Hematologije-efekata novog aktivnosti mutanta p53 u ciklusu ćeliji, apoptoze i osjetljivost na citostatike

Kršenja funkcije p53 su najsvestranijih u raznim tumora molekulyarnymizmeneniem osobe. Oni mogu voznikatlibo čak iu normalnih stanica i na taj način povećava veroyatnostobrazovaniya neoplastičnim klon, ili biti uzhev tumorskih ćelija i odrediti daljnji napredak novoobrazovaniya.Sleduet naglasiti da promjenom regulacije kletochnogotsikla punktove i apoptoze, p53 disfunkcija mijenjati chuvstvitelnostkletok na antitumorski droge.

Po pravilu, u tumora otkrila missenns mutacija p53, privodyaschiek jedna aminokiselina zamjenjuje drugu, i sa najvećim chastotoymutatsii naći u tri "žarišta": Kodonah175, 248 i 273. Vjerovatno, izraz mutanta p53 pridaje kletkedopolnitelnye selektivnu prednost u odnosu na ćelije u kojima mijenja u p53 gena dovesti do gubitka ekspressiipovrezhdennogo alela. Ova činjenica može se objasniti krayneymere dva razloga. Prvo, mutant proteina ima dominantnu negativnymeffektom protiv proteina divljeg tipa, i.e. mutatsiyadazhe tačka u jednom od dva alela je u stanju da potpuno potisnu ohrannuyufunktsiyu p53. Drugo, u posljednjih nekoliko godina postoje podaci koji ukazuju na postojanje mutiranih oblika p53 novostečena aktivnosti ("steći-of-funkcije"). Poznato je, npr, da je za schettakih aktivnosti mutiranog p53 može konkretno i sa vysokoyaffinnostyu bind MAR / SAR DNK-elemenata, uzrokujući remodelirovaniehromatina, trans-aktivirati promotori nekoliko gena (onkogena myc, epidermalni faktor rasta receptora i dr.), A uvelichivatmetastatichesky potencijal tumorskih ćelija. Međutim molekulyarnyeosnovy novostečenom aktivnosti i njihova uloga praktično nije ispitivana u kantserogenezapoka procesima.

Mi smo pokušali da se ispita uticaj novo priobretennyhaktivnostey mutanta p53 o regulaciji staničnog ciklusa, apoptozai osjetljivost na citostatike. Da biste to učinili, mi smo proučavali effektymutantnyh kiselina zamjene p53 amino u kodona 175, 248 ili273 biti "hot Spots" razlichnyhopuholyah mutacija kod ljudi. Novi mutant p53 aktivnost je otkrivena od prenosa u kulturom stanica in vitro bez produtsiruyuschieendogenny p53. Korištenje ćelija nedostaje p53 ekspressiyaendogennogo, moguće eliminirati postojanje dominantnog-negativnogoeffekta i istražiti učinak novostečene samo aktivnosteytransdutsirovannogo mutant p53.

Dobili smo i derivati ​​ljudskih ćelija analizirani myshii konstitutivne ili tetraciklina-repressible ekspressieyekzogennogo p53. U ovom drugom slučaju, izraz mutant r53podavlyalas dodavanjem tetraciklina kulturi srednje (1mkg / ml). 24-48 sati nakon prijenosa kontakt subliniykletok dobiti u podlozi bez tetraciklina indukcije poštovati ekspressiiekzogennogo mutant p53 ne prati povećanje ekspressiigenov meta divljeg tipa p53 (p21WAF1 i dr.).

Utjecaj novih aktivnosti mutiranih p53 u ciklusu ćeliji stope razmnožavanja ćelija

Novostečenih mutant p53 aktivnost uzrokuje suschestvennoeuvelichenie stopu razmnožavanja ćelija. Dakle, uvođenje vektora konstitutivno izražavanje mutanta p53-His175, povyshaetskorost reprodukciju p53-negativnih Murine fibroblasta linii10 (3) je oko 1,5 :. smanjen sa 23,5 sati do 16 sati u logaritamskom fazi rasta stanovništva ćelija uočena vremyaudvoeniya Shodnayakartina u slučaju tetraciklina regulisane ekspressiir53-His175 u ljudskoj liniji pluća karcinom N1299ili mišje fibroblasta linija 10 (1), koji je potvrdio svyazvyyavlennyh razlike u brzini širenja ekspressieymutantnogo upravo s p53, a ne s bilo kojim sekundarne promjene voznikayuschimiv rezultat kontinuiranog selekcije sa egzogeni mutantnymr53 ćelija. Treba naglasiti da je indukcija izražavanja divljeg tipa p53 mobilnih konteksta dovela ne do smanjenja već uvelicheniyuvremeni udvostručavanje stanovništva ćelije ili apoptoza.

Ubrzanje od ćelija proliferacije pod uticajem novo priobretennyhaktivnostey mutanta p53 je zbog, po svemu sudeći, njihova vozdeystviemna regulaciju staničnog ciklusa. Analizirajući kinetiku izgled mechenyhmitozov nakon toga od 5-bromodeoxyuridine za 20 min., Mi opredelyaliprodolzhitelnost pojedine faze staničnog ciklusa rasta logarifmicheskoyfaze. Utvrđeno je da je uključivanje izražavanja mutanta r53znachitelno smanjuje vrijeme za staničnog ciklusa trajanja skraćivanje schetsuschestvennogo S-fazu. Tako mutantnyyr53 nema značajan utjecaj na trajanje drugihfaz ćelijskog ciklusa.

Novostečene mutant p53 aktivnost, pored izmeneniyregulyatsii staničnog ciklusa u normalnim fiziološkim uvjetima, može izmijeniti G1-punktu funkcija Activatable povrezhdayuschimivozdeystviyami. Otkrili smo da je indukcija izražavanja mutantnogor53-His175 ćelija 10 (1) i H1299 dovodi do toga da je S-fazuvhodit 1,5-2 puta više ćelija sa oštećenjem DNK, indutsirovannymialkiliruyuschim spoj etil METHANESULFONATE (EMS), a zatim p53 divlje kakekspressiya tip, naprotiv, smanjuje udio povrezhdennyhkletok uključene u S-fazu. U isto vrijeme, p53-His175 prakticheskine utiče na aktivnost punkta koje posluju u G2.

Mehanizmi smo identifikovali efekte novostečene aktivnosteymutantnogo p53 u regulaciji staničnog ciklusa do neyasny.Naibolee uvjerljivo je pretpostavka da ovi izmeneniyasvyazany sa sposobnošću p53-His175 povećavaju izraz genamyc. Svoje proizvode, kao što je prethodno prikazano, može, s jedne strane, trans-aktivira gen ornitin dekarboksilaze, i poziva, Tako bolest, skraćenje S-fazi, a sa druge strane aktivirati kompleksytsiklin E / Cdk2 i otkazati stanica oštećenih ćelija u perehodeiz G1 u S .

Utjecaj novih aktivnosti mutiranih p53 u indukciji apoptoze

Mutant p53 može izmijeniti učinak citostatika, samo izmenyayane propis G1-punkt, ali i slabljenje indukcije apoptoza.Pri ove nove aktivnosti mutanta čin p53 kao naapoptoz izazvao oštećenja DNK i apoptoze izazvane"smrt domena" ("smrt receptori") U kulturi srednje posledobavleniya TNF-a ili anti-Fas. Sleduetpodcherknut da takvi efekti mutanta p53 u velikim stepenizavisyat na specifične supstitucije amino kiseline, kao što su apoptoze i eventualno ćelijski kontekstu. Prema tome, p53-His175, mnogo snažnije nego p53-Trp248 ili p53-His273, inhibira apoptoze izazvane DNK povrezhdayuschimivozdeystviyami (EMC, etopozid). U isto vrijeme, p53-His273 jači nego p53-His175, potiskuje FAS-inducirana-apoptoze u prostate raka chelovecheskihkletkah linija Pc-3. Osim toga, razni mutantnyer53 različito utjecati apoptoza inducirana Fasi TNF-a.

Mehanizmi djelovanja novostečena aktivnosti u regulaciji apoptoze mutantnyhr53 studirao do prilično loše. Nedavnoobnaruzheno da je jedan način tih propisa može yavlyatsyatrans BAG1 aktivacije gena koji kodira antiapoptotic beloksemeystva BCL2.

Utjecaj novih aktivnosti mutiranih p53 u hemoterapijama chuvstvitelnostk

Osim ne-specifične efekte na osjetljivost na tsitostatikamposredstvom promjene u regulaciji staničnog ciklusa i apoptoze, novyeaktivnosti mutant p53 može imati više spetsificheskoedeystvie osjetljivost na određene droge sredstvamputem promjene u regulaciji hemoterapije ciljeva. Koristeći hibridizacije metodsubtraktivnoy utvrdili smo nepoznati raneemisheni transactivation mutanta p53 akcije i otkrio da je grupa gena posebno aktivira se mutanta p53 gena uključuje kodiranje dezoksi-UTP-ase. Funkcija dUTFazy zaklyuchaetsyav hidrolize dUTP baciti i pirofosfat. S druge strane, da se formira DUMP sluzhitsubstratom dTTP de novo. Pretpostavlja se da povyshenieurovnya dUTFazy mogu izazvati otpornost na 5-fluorouracil, shirokoprimenyaemomu citostatika čiji mehanizam djelovanja inhibirajući sintezu svyazans dTTP timidilatsintetazy.My potiskivanjem aktivnost je utvrdio da indukcija p53-His175 ili p53-His248, kao i uvođenje konstrukt izražavanja UTP -azu, čak iu svim istraživanim kulturama (karcinom pluća H1299 je, rakyaichnika SKOV-3, fibroblasta 10 (1) na 1,5-2 puta povećan chislokletok u stanju da formiraju kolonije nakon izloženosti 5-fluorouracil a.Pri ovu otpornost na dva različita droge - metotreksatui adriamicina - nije povećala u isto vrijeme p53-His273, neobladayuschy sposobnost da trans-aktivirati gen UTP-ase ne uvelichivalustoychivost podataka staničnoj kulturi u 5-fluorouracil ..

Očito, postoje i drugi načini na koje mutanta p53 aktivnost vnovpriobretennye uticaj chuvstvitelnostkletok određenim citostatika. Dakle, otkrili smo da vleykoznyh K562 ćelije, za razliku od ćelija 10 (1) i dr., Expression p53-His175 uzrokuje značajno smanjenje chuvstvitelnostik metotreksat. Izraz ove mutanta nekoliko uvelichivalatakzhe otpornost ćelija leukemije u vinblastin akciju noprakticheski nije promijenilo osjetljivost na etopozid. Istovremeno, izraz p53-His273 ne spusti, već naprotiv, nekoliko povyshalachuvstvitelnost K562 ćelije metotreksat, i vinblastin. Mehanizmyetih efekti ostaju nejasni.

Dakle, otkrili smo da novostečeni aktivnostimutantnyh p53 zamjene aminokiselina na različitim pozicijama razlichnymobrazom utjecati na osjetljivost na različite kemoterapije droga. Prietom mogu razlikovati ne samo efekata različitih mutanata p53 vode i istog tipa ćelija, ali i akciju iste mutantav ćelije različitog porijekla. Sve ovo je potrebno uchityvatpri u toku pokušaja ispolzovatmutatsii p53 za predviđanje rezultata antitumorski kemoterapije.