Osnove molekularne terapije. genska terapija

Video: molekularne osnove individualizacije terapije sa čestim mutacijama u NSCLC

Utvrđivanju lokacije i sekvence gena čije mutacije izazvati pojedine bolesti, kao i većina modernih metoda mutacije i njeno testiranje može dijagnosticirati bolest u neo, pa čak i prenatalni razvoj organizma. Zbog toga je moguće da se ublaže manifestacija genetskog defekta tretmana droge, dijeta, transfuziju krvi, itd

Međutim, ovaj pristup ne dovodi do korekcije defekta i, općenito, nasljedne bolesti se ne mogu otkloniti. Situacija se komplicira činjenica da je mutacija jednog gena može proizvesti različite učinke na tijelo. Ako je mutacija uzrokuje promjenu u aktivnosti enzima za koju kodova, to može dovesti do nakupljanja toksičnog podloge ili, alternativno, na nedostatak jedinjenja neophodna za normalno funkcionisanje ćelija.

Dobro poznati primjer takve bolesti fenilketonurije. Ona je uzrokovana mutacija gena za enzim jetre fenilalanindegidroksilazy katalizator konverziju fenilalanin u tirozin. Rezultat je povećana endogene nivo fenilalanina u krvi, što dovodi do nepravilnog formiranja mijelina omotač oko aksona nervnih ćelija centralnog nervnog sistema i kao rezultat toga, teške mentalne retardacije.

Ako je mutacija utječe na strukturne proteina gena, onda to može dovesti do ozbiljnih poremećaja na nivou ćelija, tkiva ili organa. Primjer takve bolesti cistične fibroze.

Brisanje u gen koji kodira protein zove cistična fibroza transporter dovodi do sinteze neispravne proteina (nedostatak fenilalanin 508) i poremećaja transporta kloridnih iona kroz stanične membrane. Jedan od najvažnijih štetnih posljedica toga je da sluzi da linije i štiti pluća, postaje nenormalno debeo. Ovo otežava pristup ćelije pluća i doprinosi akumulacije štetnih mikroorganizama. Ćelije obloge disajne puteve pluća, ubijaju i zamijenjen vlaknastih ožiljak (otuda i ime bolesti). Kao rezultat toga, pacijent umre od respiratorne insuficijencije.

Nasljedne bolesti se razlikuju kompleks kliničkih simptoma i njihov tretman traditsinnoe uglavnom simptomatska: za liječenje fenilketonurije bezalaninovuyu propisane dijete, zamijeniti neispravne funkcionalan proteina intravenske primjene, da nadoknadi izgubljeno funkcije koje obavljaju transplantacije koštane srži ili drugih organa. Sve ove mjere su uglavnom neefikasne, skupo, izdržljiv, i nekoliko pacijenata preživi starosti. Stoga, razvoj novih terapija je vrlo hitno.

genska terapija

Genska terapija se zove genetski inženjering ljudskih somatskih ćelija, u cilju ispravljanja genetski defekt koji uzrokuje bolest. Korekcija od specifičnih bolesti se vrši uvođenjem u neispravne ćelije normalnih somatskih izrazio gena. Do 80 godina. Kada se stvorili razvijene metode za pripremu pojedinačnih gena i eukariotskih izraz vektora, to postaje rutina eksperimenata transfera gena kod miševa, korekcija genetske perspektive postanu stvarnost.

Godine 1990. u SAD-u dr W. French Anderson (W. francuski Andrson) prvi pokušaj genske terapije za liječenje teških kombinovanih imunodeficijencije (SCID) u tri godine Žena Ashanti de Silva (Ashanthi da Silva) nije bilo. Ova bolest je uzrokovana mutacijom gena koji kodira adenozanadenilazu (ADA). Nedostatak ovog enzima olakšava akumulacije adenozina i deoxyadenosine krvi, od kojih su toksične akcije dovodi do smrti B i T limfocita u perifernoj krvi i, kao posledica imunodeficijencije.

Djeca sa ovom bolešću treba zaštititi od bilo kakvih infekcija (koje se nalaze u posebnim sterilnim komorama), kao i svaka bolest može biti fatalna. 4 godine nakon početka liječenja djeteta je uočio izraz normalno funkcioniše ADA SCID i olakšanje simptoma, što je omogućilo da napusti sterilne komore i normalan život.

Tako je, dokazano je, u principu, mogućnost uspješne genske terapije somatskih ćelija. S obzirom da je 90-ih godina. testirao broj genske terapije genetskih bolesti, među kojima su najteže, kao hemofilija, AIDS-a, razne vrste zloćudnih tumora, cistične fibroze i dr. Trenutno obradivi kroz transgeneza oko 10 ljudskih bolesti.

Mnoštvo genetskih bolesti predodređeni pluralitet razvoja pristupa genske terapije. Tako je riješeno dva glavna problema: sredstvo za isporuku terapijskih gena- metoda za pružanje ciljane isporuke do ćelija namijenjen za korekciju. Do sada, sve pristupe genske terapije somatskih ćelija mogu se podijeliti u dvije kategorije: (. Slika 3.15) ex vivo terapija i in vivo.

Sl. 3.15. Shema ex vivo genske terapije (a) i in vivo (a)

ex vivo genske terapije uključuje ispravljanje genetski defekt ćelija izvan tijela i zatim se vrati na normalno funkcionisanje ćelija u organizmu.

in vivo genske terapije uključuje isporuku terapijskih gena direktno u ćelije određenog tkiva pacijenta. Razmislite o ovih pristupa detaljnije.

ex vivo gensku terapiju uključuje sljedeće korake:
1) pružanje pacijent manjkav ćelije i da ih kultivacije;
2) prenošenje željenih gena u izolovana ćelije transfekcije terapijskog gena konstrukt;
3) izbor i kapacitet genetski ispraviti ćelije;
4) transplantacija ili transfuziju tih ćelija u pacijenta.

Vlastitim ćelija pacijenta osigurava da po povratku on nije razviti imunološki odgovor. transfer postupak gena konstrukta treba da bude efikasna, ali normalan gen treba održavati stabilno i stalno izražena.

Sredstva za transfer gena stvorila priroda, su virusi. Da bi se dobila efikasnu vektora isporuke gena za dva grupu virusa se uglavnom koristi - (. Vidi sliku 3.16) adenovirusi i retrovirusa. genetski detoksikuju varijante virusa koji se koriste u genske terapije.

Sl. 3.16. Virusi se koristi za stvaranje terapeutskog vektora

Razmotrite uređaja i korištenje koja se temelji na retro-viruse. Podsjetimo da je antiretroviralne genom sadrži dva identična RNK molekula, od kojih svaki se sastoji od šest dijelova: dva duga terminal ponavljanja (LTR) na 5` i 3` završava slijed nekodirajuće * P + nužno za pakovanje RNK u virusnu česticu, i tri regije kodiraju strukturne proteine unutrašnjeg kapside (GAG), reverzne transkriptaze (pol) i koverta proteina (env) (Sl. 3.17, a).

Sl. 3.17. Genetsku kartu tipičnog retrovirus (a) i retrovirusa vektorske mape (a)

Podsjetimo da je retrovirus životni ciklus se sastoji od sljedećih koraka:
1. Infekcija ciljne ćelije.
2. Sinteza DNK kopija genoma sa native reverzne transkriptaze.
3. Transport virusne DNK u jezgru.
4. Integracija virusne DNK u hromozoma ćelije domaćina.
5. Aranžman mRNA iz virusne DNA pod kontrolom jakog promotora lokalizovan na 5`-LTR dio.
6. Broadcast proteina Gag, Pol i okoliša.
7. Formiranje virusne kapside i paušalne dva RNK molekula lanaca i reverzne transkriptaze.
8. oslobađanje viriona iz ćelije.

U pripremi antiretroviralne vektor dužine DNK retro virus ubaci u plazmida ukloniti većinu geg gena i potpuno gena pol i env, i umjesto toga ubaci "terapeutski" gen T i opcionalno marker selektivni Rg gen sa vlastitim promotor (Sl. 3.17, b ). Aranžman T gen će biti pod kontrolom istog snažan promoter lokaliziran na 5`-LTR dio. na ovoj šemi na osnovu pruža različite retrovirusnih vektora, a maksimalna veličina DNK umetak od oko osam hiljada. Bp

Tako je dobivena struktura mogu se koristiti samo po sebi za transformaciju, ali njegova efikasnost i kasniju integraciju u genom domaćina ćelije je izuzetno niska. Stoga, tehnika pakiranja ukupne RNK antiretroviralne vektor u netaknuta virusnih čestica je razvijen, koja je sa visoke frekvencije u ćeliju i prodire garantuje u integriran u genom domaćina. Za ovaj takozvani "pakuyuschaya" stanična linija je uspostavljena. Dva različita dijelove kromosoma ćelija ušivenim antiretroviralne gena gag i pol-env, lišen sposobnosti da spakujem zbog nedostatka konzistentnosti + (84 * +) (Sl. 3.18).

Sl. 3.18. Sheme za dobijanje upakovanog virusni vektor

To jest, oba ova fragmenata prepisuju, ali u isto vrijeme ostala uskraćena za RNK prazan capsids. Od transfecting virusni vektor RNK u takve ćelije je inkorporiran u kromosomske DNA i transkribovana za proizvodnju pune dužine RNK retrovirus, i pod tim uslovima pakirani u capsids samo RNA vektora (samo sadrži niz +). Rezultirajući netaknuta virus čestice se koriste za efikasnu isporuku antiretroviralne vektora u ciljnu ćeliju.

Retrovirusi inficiraju samo aktivno dijeljenjem ćelija intenzivno. Da prenesu svoje gene je tretirana sa pročišćenim čestice upakovanog antiretroviralne vektor ili ko-kultivirani sa linije ćelija koji ih proizvode, a zatim izvršite odabir za odvajanje ciljne ćelije i ambalaže ćelije.

Transduced ćelije su detaljno pregledava za razinu terapeutskog sinteze gena proizvod, nepostojanje nadležnog retrovirus replikacije, bez promjena na sposobnost ćelija da rastu ili funkcije.

Posebno pogodan za gensku terapiju su ćelija koštane srži. Ovo je zbog prisustva totipotentna embrionalnih matičnih stanica, koje se razmnožavaju i diferenciraju u različite vrste -B- ćelija i T limfocita, makrofaga, eritrociti, trombociti i osteoklasta. Ove ćelije se koriste za liječenje niz nasljednih bolesti, a među njima smo već spomenuli teškom kombiniranom imunodeficijencije, Gaucherova bolest, anemija srpastih ćelija, talasemija, osteoporoze i drugih.

Osim totipotentna matičnih stanica koštane srži koje je teško izolirati i njegovati rabljene pupovinnoy matičnih ćelija iz krvi (preferirani korištenje genske terapije za dojenčad) i ćelije jetre - hepatocita - za liječenje hiperholesterolemije.

U in vivo genske terapije posebno je važno osigurati isporuku terapijskih gena na neispravne ćelije. Takva ciljana isporuka može pružiti izmijenjena vektori koji se zasnivaju na viruse koji mogu zaraziti određene vrste stanica. Smatraju da je pristup razvijen za liječenje već gore navedenih cistične fibroze. S obzirom na pluća su otvorene šupljine, terapeutski geni dostaviti ih je relativno lako. A klonirane varijanta zdravog gena je uvedena u inaktivisanom adenovirus (sl. 3.19). Specifičnost ove vrste virusa je da se inficira sluznice pluća, uzrokujući hladno.

Sl. 3.19. Shema za dobijanje vektor na osnovu adenovirus

Dizajniran tako da je virus testiran prskanjem ga u nos i pluća eksperimentalnih životinja i onda ljudi-pacijenata. U nekim slučajevima, postoji uvođenje i izraz zdravog gena, i obnovu normalnog transporta klorida jona. Možda je ovaj pristup (uvođenje normalnih gena nazalnog aerosola) u bliskoj budućnosti će biti široko koristi za liječenje simptoma cistične fibroze u plućima.

Osim retro- i adenovirusi u eksperimentima genske terapije o korištenju i druge vrste virusa, kao što su herpes simplex virus. Karakteristika ove dvolančane (152.000. Bp) DNK virus je njegova sposobnost da se posebno pogoditi neurona. Postoje mnoge genetske bolesti koje pogađaju centralnog i perifernog nervnog sistema - tumori, metabolički poremećaji, neurodegenerativnih bolesti (Alzheimerova bolest, Parkinsonova bolest).

Herpes tip simplex virus I (HSV) vektor je vrlo pogodan za liječenje takvih bolesti. Je kapside virusa spaja sa membrane neurona, a DNK se transportira u jezgru. To je predložio nekoliko načina prenošenja terapeutskog gena preko HSV-vektora i uspješno testiran u eksperimentalnih životinja.

Virusni vektori imaju nekoliko nedostataka: visokim troškovima, ograničene kapacitete klonirane i moguće upalne reakcije. Dakle, u 1999. godini, koje je razvila zbog čega neobično jak imuni odgovor na adenovirus vektor je ubijen 18-godišnji volonter, koji su učestvovali u ispitivanjima droga. U 2002. godini, u Francuskoj dvoje djece za vrijeme liječenja imunodeficijencije (uvođenje terapijskih gena u matične ćelije pomoću retrovirusa) razvila je stanje slično leukemije.

Stoga razvio nonviral sistema za isporuku gena. Najlakši i većina neefikasan način - to je injekcija plazmida DNK u tkivo. Drugi pristup - je microprojectile bombardovanje tkanina zlato (1-3 mikrona) konjugovanih DNK. Tako je terapeutski geni su izražene u ciljna tkiva i njihovih proizvoda - terapeutski proteini - ulaze u krvotok. Glavni nedostatak ovog pristupa je preuranjeno inaktivacije ili uništavanje ovih proteina sa komponentama krvi.

Isporuka DNK se može postići pakovanje ga u umjetni lipida membrane. Tako je dobivena sferne čestice, liposoma mogu lako probiti kroz ćelijsku membranu. Liposome kreiran sa različitim svojstvima, ali do sada efikasnost takve isporuke je niska, jer je većina DNK je podvrgnut Lizozomne degradacije. Također sintetizovana DNK konjugata za isporuku genetskog konstrukta na različite molekule koji mogu osigurati njegove sigurnosti, ciljane isporuke i prodora u ćeliju.

U posljednjih nekoliko godina intenzivno eksperimente za stvaranje umjetnih kromosoma 47, što bi omogućilo da se uključe veliku količinu genetskog materijala sa punim skup regulatornih elemenata za jedan ili više terapeutskih gena. To bi bilo moguće koristiti genomske verziju terapeutskog gena i time osigurati njegovu stabilnost i efikasnu dugoročnu izražavanja. Eksperimenti su pokazali da je stvaranje umjetnih ljudskih kromosoma koji sadrže terapeutski gene je realan, međutim, nije jasno kako je tako ogroman molekula uvodi u nukleus ciljne ćelije.

Glavni problemi s kojima se suočavaju genske terapije, uz rizik od ozbiljnih imune reakcije su teško dugotrajno skladištenje i rad terapijskih DNK u tijelu pacijenta, mnogi multigenske bolesti, što ih je teško ciljati za gensku terapiju, a rizik od upotrebe virusa kao vektora.

NA Warriors, TG Volova

Udio u društvenim mrežama:

Povezani