Laboratorijske metode istraživanja. proteinurija

Video: laboratorijske studije: Hematologija

Male količine proteina se nalaze u dnevnom urinu zdravih osoba. Međutim, takve niske koncentracije ne može se otkriti konvencionalnim metodama istraživanja. Izolacija veće količine proteina za koje konvencionalne kvalitativni testovi za proteina u urinu postao pozitivan, naziva proteinurija. Razlikovati bubrega (true) i ekstrarenalno (false) proteinurija. Bubrega proteinurija proteina u urinu prodire direktno iz krvi zbog povećanja njegove filtriranje ili smanjenje u bubregu glomerula reapsorpcije.

Bubrežne (true) proteinurija

Bubrežne (true) proteinurija je funkcionalan i organski. najčešće posmatra nakon njene vrste među renalnom proteinurija:

- fiziološke proteinurija bebe koja nestaje od 4 do 10 dana nakon poroda, i prijevremenog kasnije;
- ortostatska albuminurija, što je tipično za djecu od 7-18 godina, a pojavljuje se samo u vertikalnom položaju tijela;
- prolazne (moždani udar) albuminurija, što može biti uzrok raznih bolesti organa za varenje, teške anemije, opekotine, povrede ili fiziološkim faktorima teške vježbe, hipotermija, jake emocije, u izobilju, hrane bogate proteinima i drugi.

Organic (bubrega) proteinurija se posmatra zbog proteka proteina iz krvotoka kroz oštećene dijelove endotelne bolesti glomerula bubrega (glomerulonefritis, nefroza, Nefroskleroza, amiloidoza, nefropatija trudna), poremećaji bubrežne hemodinamike (bubrežna venska hipertenzija, hipoksija), trofičke i toksičnih (uključujući uključujući i lijekove) efekte na glomerularne kapilara zidove.

Ekstrarenalno (false) proteinurija

Ekstrarenalno (false) proteinurija u kojem izvor proteina u urinu primjesom leukocita, eritrocita, bakterije, urotelna ćelija. zabilježene za vrijeme urološka oboljenja (kamenci, bubrežne tuberkuloze, bubrega i tumora urinarnog trakta, itd.)

Određivanje proteina u urinu

Većina kvalitativnih i kvantitativnih metoda za određivanje proteina u urinu na osnovu svog koagulacije u volumenu urina ili na sučelje (i kiselina urin).

Dodatni kvalitativne metode za određivanje u urinu bedka najčešće standardizirani test sulfosalicilnom kiselinom i prstenastog uzorka Geller.

Standardizovani test sulfasalitsilovoy kiselina odvija se na sljedeći način. Dvije cijevi se sipa na 3 ml filtrirane urina. Jedan od njih je dodan 6-8 kapi 20% sulfasalitsilovoy kiseline. Na tamnoj pozadini se uspoređuju obje cijevi. Zamagljuje urin u epruvetu sulfasalitsilovoy kiselina ukazuje na prisustvo proteina. Prije studija potrebno je odrediti reakcije urina, a ako je alkalna, a zatim zakiseljeno sa 2-3 kapi 10% otopina octene kiseline.

Geller uzorak na osnovu činjenice da je prisustvo proteina u urinu u interfejsu dušične kiseline i urin koagulacije javlja i čini se beli prsten. U epruvetu se sipa 2,1 ml 30% rastvora azotne kiseline i lagano slojevita na zidu cijevi je ista količina filtrirane urina. Izgled beli prsten na granici dva fluida ukazuje na prisustvo proteina u urinu. Treba imati na umu da je ponekad beli prsten se formira sa velikim brojem urata, ali za razliku od proteina čini se prsten malo iznad granice između dva fluida i rastvorene podno grijanje [Pletnev NG 1987].

Kvantitativnih metoda se najčešće koriste:

1) jedinstveni način Brandberg-Roberts-Stolnikova, oslanjajući se na prstenaste uzorku Geller;
2) fotoelektrokolorimetrichesky način kvantitativno određivanje proteina u urinu izmaglici formirana nakon toga sulfasalitsilovoy kiselina;
3) biureta test.

Protein Identifikacija u urinu pojednostavljena ubrzan način se vrši kolorimetrijski koristeći indikator papir, koji je proizveden od strane «Lachema» (Slovačka), «Albuphan», «Ames» (Engleska), «Albustix», «Boehringer» (Njemačka), «Comburtest» i dr. metoda je uronjen u urinu specijalni papir trake impregnirane tetrabromfenolovym plave i Citratpuffer, koja mijenja boju od žute do plave, u zavisnosti od sadržaja proteina u urinu. Koncentracije približno proteina u test urina je određen prema standardu razmjera. Da biste dobili ispravne rezultate, moraju biti ispunjeni sljedeći uslovi. pH urina mora biti u 3,0-3,5- suviše alkalne mokraće (pH 6.5) će se dobiti lažno pozitivan rezultat, a kada previše kisela urina (pH 3,0) - lažno negativan.

Rad treba biti u kontaktu sa ispitivanim urina ne više nego što je navedeno u uputama, inače test će dati lažno pozitivne reakcije. Potonji je takođe uočio kada je sadržaj u urinu velike količine sluzi. Osjetljivost različitih vrsta papira i serije mogu biti različiti, tako da je kvantitativna procjena proteina u urinu ovom metodom treba uzeti s oprezom. Određivanje njen iznos u dnevnom urinu pomoću test papir ne može [Pletnev NG 1987]

Određivanje dnevnih proteinurije

Postoji nekoliko načina da se odredi količinu proteina oslobođen u urinu dnevno. Najjednostavnija metoda je Brandberg -Robertsa-Stolnikova.

Metodologije. 5-10 ml dobro promešati dnevno urina sipa u cijev i zidove pažljivo je dodao 30% dušične kiseline rješenje. U prisustvu proteina u urinu u iznosu od 0.033% (i.e. 33 mg po 1 litar urina) u 2-3 minuta pojavljuje suptilan ali jasno vidljivo beli prsten. Na nižoj koncentraciji negativan uzorak. Na veći sadržaj proteina u urinu određen je iznos od urina ponavlja razblaženja sa destiliranom vodom sve dok sve dok ne prsten formiran. Konačni cijevi, u kojima je prsten je još uvijek vidljiva, koncentracija proteina će biti 0.033%. 0.033 množenjem stepen urina razrjeđivanje, sadržaj proteina se određuje u 1 l nerazblaženog urina u gramima. Onda je izračunata sadržaj proteina u dnevnom urinu prema formuli:

K = (x&Middot-V) / 1000

gdje je K - količina proteina u dnevnom urinu (g) - x - količinu proteina u 1 litru mokraće (g) - V - količina urina dnevno izdvojeno (ml).

Normalno, u toku dana urinu se oslobađa 27-150 mg (prosjek 40-80 mg) proteina.

Ovaj test omogućava da se odredi samo urin fino proteina (albumin). Preciznije kvantitativne metode (kolorimetrijski Kjeldahl i dr.) Su prilično komplicirana i zahtijeva posebnu opremu.

Bubrega proteinurija u urinu albumin ističu, ne samo, nego i druge vrste proteina. Normalno proteinogramma ima sljedeće postotak (Do Seitz, et al, 1953.): Albumina - 20%, &alfa₁-globulin - 12% &alfa₂-globulin - 17% &gama - globulin - 43% &beta - globulini - 8%. Odnos albumina u globulina varira u raznim bolestima bubrega, i.e. poremećen kvantitativni odnos između frakcije proteina.

Najčešće metode uroproteinov frakcioniranje su kako slijedi: soljenje neutralne soli, elektroforetski frakcioniranje, imunološke metode (reakcija prema Mancini radijalni immunodiffusion, imunoelektroforezom test, pretsipitatsionny imunoelektroforezom), kromatografija, gel filtracija i ultracentrifugiranje.

Uvođenje uroproteinov metode frakcioniranje na osnovu studije elektroforetske pokretljivosti, varijabilnosti molekularne težine, veličine i oblika uroproteinov molekula, moguće je izdvojiti specifične za određene studije vrste bolesti proteinurija odobrenja pojedinačnih proteine plazme. Tu su trenutno identificirani u urinu više od 40 proteina plazme, uključujući u normalnim urinu proteine plazme 31 [Berggard, 1970].

selektivna proteinurija

U posljednjih nekoliko godina, koncept selektivnosti proteinurije. 1955. godine, Hardwicke i Squire formulirali koncept "selektivno" i "neselektivni" proteinurija, utvrdivši da je filtracija plazme proteina u urinu je predmet određeni obrazac: što je veća molekularna težina proteina izlučuje u urinu, manje odstojanje od tla, a donji koncentracija u konačni urin. Proteinurija odgovara ovaj obrazac je selektivno, za razliku od neselektivne, što je karakteristično za distorziju obrasce izveden.

Detekcija proteina u urinu sa relativno visoke molekularne težine pokazuje nedostatak selektivnosti bubrega filtera i izrazila poraz. U tim slučajevima govorimo o niskom selektivnosti proteinurije. Zbog toga, u ovom trenutku raširena utvrđivanja urinu proteinskih frakcija koristeći tehnike elektroforeze u skroba i poliakrilamid gel elektroforeza. Rezultati ovih istraživanja metode mogu suditi o selektivnosti proteinurije.

Prema V.S.Mahlinoy (1975), najviše opravdano je da se odredi selektivnost proteinurije poređenjem odobrenja 6-7 pojedinačnih proteina krvne plazme (albumin, traneferrina, &alfa₂ - makroglobulin, IgA, IgG, IgM) koristeći precizan i specifične reakcije kvantitativna imunoanalize radijalne immunodiffusion prema Mancini, a imunoelektroforezom test pretsipitalnogo imunoelektroforezom. Stupanj selektivnosti određen je indeks proteinurija selektivnost, što predstavlja odnos referentne i usporedbi proteina (albumin).

Proučavajući odobrenja pojedinačnih proteine plazme omogućava dobiti pouzdane informacije o stanju filtracije podruma membrana glomerula bubrega. Vezu između prirode proteina izlučuje u urinu i promjene u glomerula podrumu membrane i izražava se kao konstanta, koja uroproteinogramme može posredno suditi patofiziološki promjene u bubrega glomerula. Normalno, prosječna veličina pora glomerularne bazalne membrane je 2,9-4 ° NM A koji može preskočiti proteine koji imaju molekularne težine do 10⁴ (Mioglobulin, kiselo &alfa₁ - glikoprotein, imunoglobulin lake lance, Fc i Fab - fragmenti IgG, albumin i transferin).

Glomerulonefritis, nefrotski veličine sindrom pora u porastu u glomerularne podrumu membrane, a samim tim i bazalne membrane postaje propušta proteina molekule velikih dimenzija i mase (ceruloplasmin, haptoglobin, IgG, IgA, i dr.). U ekstremnim bubrega glomerularna oštećenja u mokraći pojavljuju gigant molekule proteina krvne plazme (&alfa₂-makroglobulin, IgM i &beta₂-lipoprotein).

Definiranje urin proteina spektra, može se zaključiti da je primarna lezija pojedinih dijelova nefrona. Za glomerulonefritis, uglavnom utječu na glomerularna podrumu membrane karakteriše prisustvo u urinu srednje veličine i proteina. Za pijelonefritis, uglavnom utiču na bazalnu membranu kanalića karakterističnih krupnomolekulyarnyh odsustvo i prisustvo povećane količine srednje i niske proteina molekularne težine.

&beta₂-mikroglobulin

Osim dobro poznatih proteina, kao što je albumin, imunoglobulini, lipoproteina. fibrinogena, transferin, urin sadrži proteine plazme mikroproteiny, uključujući klinički interes &beta₂-mikroglobulin otvoren Berggard i Bearn u 1968. Imati male molekulske mase (relativna molekularna masa 1800), to slobodno prolazi kroz glomerula bubrega i skoro potpuno resorbuje u proksimalnom tubula. Ovo omogućuje korištenje kvantitativnog definicije &beta₂-mikroglobulina u krvi ili urina radi utvrđivanja glomerularne filtracije i bubrega sposobnost resorpcije za proteine u proksimalnim tubulima.

Koncentracija proteina u plazmi i urinu određen je radioimunoeseja koristeći standardni set «Phade-bas &beta₂-mikroiest »(kompanija" Pharmasia ", Švedska). U zdravih osoba serum sadrži u prosjeku 1,7 mg / L (Raspon podešavanja 0.6 3 mg / l) u urinu - prosjek 81 mg / l (maksimalno 250 mg / l) &beta₂-mikroglobulin. Višak urina u svojoj preko 1000 .mu.g / l - patološki fenomen. sadržaj &beta₂-mikroglobulina u krvi raste u bolesti povezanih sa oštećenim stopa glomerularne filtracije, posebno kod akutnih i hroničnih glomerulonefritis, policistične bolesti bubrega, Nefroskleroza, dijabetička nefropatija, akutno zatajenje bubrega.

koncentracija &beta₂-mikroglobulina u urinu se povećava u bolesti povezanih s oštećenom funkcijom reabsorbtsionnoy tubula, što dovodi do povećanja u svojoj izlučivanje u urinu u 10-50 puta, posebno u pijelonefritis, hronične bubrežne insuficijencije, gnojni intoksikacije et al. Karakteristično je, cistitis za razliku od ne pijelonefritis posmatranom povećanja koncentracije &beta₂-mikroglobulina u urinu, koji se može koristiti za diferencijalnu dijagnozu ove bolesti. Međutim, kada tumačenju rezultata istraživanja treba uzeti u obzir da svako povećanje temperature se uvijek praćen povećanjem izlučivanja &beta₂-mikroglobulina u urinu.

Prosjek krvi i urina molekula

Prosjek molekula (SM), inače se zove proteina toksina su supstance sa molekularne težine 500-5000 daltona. Njihova fizička struktura je nepoznat. Struktura CM sastoji se od najmanje 30 peptide: oksitocin, vazopresin, angiotenzin, glukagon, adrenokortikotropni hormon (ACTH), itd Prekomjerna akumulacija CM se posmatra sa smanjenjem bubrežne funkcije i sadržaja u krvi veliki broj deformirane proteina i njihovih metabolita .. Oni imaju raznolika biološka aktivnost i neurotoksičnosti sekundarnih uzroka imunosupresija, sekundarna anemija, inhibiraju eritropoeze biosintezu proteina i inhibira aktivnost mnogih enzima koji remete faze upale.

SM nivo u krvi i urina skrining se određuje, kao i spektrofotometrijski u ultraljubičastom valne duljine površine od 254 i 280 mm spektrofotometar CI-8B i dinamičan spektrofotometrija sa kompjuterskom obradom u 220-335 nm opsegu talasnih dužina u istoj firmi Beckman spektrometar . Tokom normalnog dobiti sadržaj CM krvi jednak 0,24 ± 0,02 USL. jedinice, a u urinu -. 0,312 ± 0,09 konv. U
Kao normalan život proizvoda organizma, oni su uklonjeni iz normalne noćne strane glomerularne filtracije na 0,5% - 5% koriste drugi. Sve frakcije SM izloženi reapsorpcije.

Neplazmennye (tkiva) uroproteiny

Osim proteina krvne plazme, u urinu može se neplazmennye (tkiva) proteina. Prema Buxbaum i Franklin (1970), neplazmennye proteini čine oko 2/3 svih urina i biocolloids uroproteinov značajan dio na patološke proteinurije. Tkiva proteini spadaju direktno u urin iz bubrega ili organa su anatomski povezana sa urinarnog trakta, ili pada iz drugih organa i tkiva u krv, a iz njega kroz bubreg glomerularna podrumu membrane - u urinu. U ovom drugom slučaju, izlučivanje proteina u uklanjanju urinu tkiva javlja analogno za proteine plazme različite molekularne težine. Sastav neplazmennyh uroproteinov vrlo raznolik. Među njima, glikoproteini, hormoni, antigeni, enzimi (enzimi).

Tkiva proteini otkrivena u mokraći koristeći konvencionalne metode proteina hemije (ultracentrifugiranje, gel kromatografije, elektroforeza, razne embodiments), posebne odgovore na hormone i enzime i imunološkim metodama. Potonji omogućuje i da se odredi koncentracija neplazmennogo uroproteina u urinu, au nekim slučajevima za identifikaciju strukture tkiva, koje su postale izvor svom izgledu. Osnovni metod za detekciju proteina u urinu neplazmennogo analiza immunodiffusion sa antiseruma dobiti imunizacije eksperimentalnih životinja i ljudskih urina odvodi (adsorbovane) u sljedećem proteine plazme.

Studija enzima u krvi i urina

Kada je proces bolesti poštovati duboko oštećenje vitalnih ćelija, u pratnji oslobađanje intracelularnih enzima u fluid okruženje tijela. Enzimodiagnostika se temelji na definiciji broja enzima izoliran iz ćelija oštećenih organa i ne svojstvena seruma.
Istraživanja nefrona ljudi i životinja su pokazala da su neki od njegovih dijelova imaju visoku enzim diferencijacije, usko povezan sa funkcijama koje obavlja svaki odjel. U glomerula bubrega sadrži relativno mali broj različitih enzima.

Bubrežne tubule ćelije, posebno proksimalno da sadrži maksimalan broj enzima. Njihova visoka aktivnost je uočena u petlju Henle, ravno tubula i sabirnih kanala. Promjene u aktivnost određenih enzima u raznim bolestima bubrega ovisi o procesu prirodi, ozbiljnosti i lokalizacije. Oni se poštuju prije morfološke promjene u bubrezima. S obzirom da je sadržaj različitih enzima jasno lokaliziran u nefrona, definicija određenog enzima u urinu može doprinijeti tematska dijagnozu patoloških procesa u bubrezima (glomerula, tubula, korteksa i medule), diferencijalna dijagnoza bubrežne bolesti i odrediti dinamiku (damping i pogoršanja) proces u bubrega parenhima.

Dužina diferencijalnoj dijagnozi bolesti urogenitalnog sistema se koristi za određivanje aktivnosti u krvi i urina od sljedećih enzima: laktat dehidrogenaze (LDH), leucin aminopeptidaza (ZUP), kisela fosfataza (AP), alkalna fosfataza (ALP), &beta -. Glukuronidazna, glutaminska-oxaloacetic transaminaza (GSCHT), Aldolaza transamidinase itd Aktivnost enzima u serumu i urinu je određen prema biokemijske, spektrofotometrijski, hromatografska, fluorimetric i hemiluminiscentni metoda.

Enzimuriya bubrežne bolesti je izraženiji i prirodno, nego enzimemiya. Posebno je snažno izražena u akutnoj fazi bolesti (akutni pijelonefritis, traume, tumora propadanja, infarkta bubrega, itd.) U ovih bolesti otkrivene transamidinase visoku aktivnost, LDH, alkalna fosfataza i KF, Hyaluronidase, ZUP i nespecifični enzima, kao što su GSCHT, katalaze [Polyantseva LR 1972].

Selektivna lokalizacija enzima u nefrona nakon otkrivanja ZUP i alkalne fosfataze u urinu mogu sa sigurnošću reći akutnih i hroničnih bolesti bubrega (akutni zatajenja bubrega, bubrežne tubularne nekroze, hronični glomerulonefritis) [Shemetov VD 1968]. Prema A.A.Karelina i L.R.Polyantsevoy (1965) transamidinase sadrži samo dva tijela - bubrega i gušterače. To je mitohondrijski enzim i bubrega u normalnoj krvi i urina odsutan. U raznim bolestima bubrega transamidinase se pojavljuje u krvi i urina, au pankreasa lezije - samo u krvi.

Diferencijalni test u dijagnostici glomerulonefritis i pijelonefritisa Krotkiewski (1963) smatra da je aktivnost alkalne fosfataze u urinu, što je rast koji je tipičan za pijelonefritis i dijabetičke glomeruloskleroze nego za akutni i hronični nefritis. Povećanje dinamike amilazemiya uz smanjenje amylasuria može ukazivati na Nefroskleroza i bubrega ožiljaka, ZUP ima najveću vrijednost u patološke promene u glomerula i zamršenim tubula bubrega, jer je njegova koncentracija u tim regijama nefrona viši [Shepotinovsky VP et al., 1980]. preporučene definicija za dijagnozu lupus nefritis &beta - Glukuronidazna i CF [Privalenko MN et al., 1974].

U procjeni enzimurii ulogu u dijagnostici bolesti bubrega treba uzeti u obzir sljedeće odredbe. Enzimi, što po sebi proteina sa malim molekularne težine mogu proći kroz netaknuta glomerula, definiranje tzv fiziološke enzimuriyu. Među ovih enzima stalno utvrđuje u urinu &alfa - amilaze (relativna molekularna masa 45 doo) i uropepsin (relativne molekulske mase 38.000).

Uz enzimi niske molekularne težine u urinu zdravih osoba može se naći u malim koncentracijama i drugih enzima: laktat dehidrogenaze, aspartat i alanin aminotransferaze, alkalna fosfataza, i KF, maltase, Aldolaza, lipaze, proteaze i razne peptidaze, sulphatase, katalaze, ribonukleaze, peroksidaze [King, Boyce 1963].

Visoke molekularne enzima sa relativnom molekulskom masom od više od 70000-100000, prema Richterich (1958) i Hess (1962), može prodrijeti u urinu samo u suprotnosti sa glomerularne propusnosti filtera. Normalno sadržaj enzima u urinu ne isključuje patološkog procesa u bubrezima sa uretera okluzija. Kada epzimurii moguće izlaz enzimi ne samo od samih bubrega, ali i iz drugih parenhima organa, sluznicu ćelije urinarnog trakta, prostate i urina formirana elemente s hematurija ili leukocyturia.

Većina enzima nespecifično u odnosu na bubreg, dakle odakle enzima zdravih i bolesnih u urinu, teško je utvrditi. Međutim, stepen enzimurii čak dužine nespecifičnih enzima kada bolest bubrega je veća od normalne ili ono što se posmatra u bolestima drugih organa. Za više vrijedne informacije mogu pružiti sveobuhvatnu studiju dinamike brojnih enzima, posebno organ specifične, kao što je transaminaza.

U rješavanju problema bubrežnog porekla enzima u urinu pomaže da studiraju izoenzima u identifikaciji frakcije tipičan ispitivanih organa. Izoenzima - to enzimi djelovanjem izogene (katalizirati istu reakciju), ali heterogena u kemijskoj strukturi i druga svojstva. Svaka tkanina ima karakterističan za nju izoenzima spektra. Vrijedni izoenzima tehnike odvajanja su elektroforeza u skroba i poliakrilamid gel elektroforeza i ionskom izmjenom kromatografije.

Bence-Jones proteina

U multipli mijelom i Waldenstrom macroglobulinemia u urinu otkrivena protein Bence Jones. Metoda otkrivanja rekao proteina u urinu se temelji na termopretsipitatsii reakcije. Ranije se koristi metode kojima raspada proteina se procjenjuje na temperaturi od 100 ° C i reprecipitation sa naknadnim hlađenja, nepouzdani, jer nisu svi proteini tijela Bence Jones posjeduje odgovarajuće svojstva.

A više pouzdana detekcija paraprotein od taloženja je na temperaturi od 40 -60 ° C Međutim, u ovim taloženje uvjetima ne može doći do previše kisela (pH < 3,0—3,5) или слишком щелочной (рН > 6,5) моче, при низкой ОПМ и низкой концентрации белка Бенс-Джонса. Наиболее благоприятные условия для его осаждения обеспечивает методика, предложенная Patnem: 4 мл профильтрованной мочи смешивают с 1 мл 2 М ацетатного буфера рН 4,9 и согревают 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белка Бенс-Джонса в течение первых 2 мин появляется выраженный осадок.

Kada je koncentracija proteina Bence Jones manje od 3 g / L uzorak može biti negativan, ali u praksi je izuzetno rijedak, budući da je koncentracija u urinu je uglavnom značajnije. Na test interval ne može u potpunosti osloniti. Sa sigurnošću se može se otkriti u urinu imuno-elektroforetske metode pomoću određenih seruma protiv lakih i teških imunoglobulina lanaca.

NA Lopatkin

Udio u društvenim mrežama:

Povezani