Preimplantation gen dijagnostika

Njene kombinacije sa test za aneuploidije može poboljšati rezultate IVF. DNK prijemplantacionog genodiagnostic priprema od polarnog tijela, biopsija korak od prignječenja bilo zigota biopsija blastociste.

DNK analiza se provodi na polarnoj tijelo postupka oocita II faza. Glavni nedostatak ove metode leži u činjenici da je, kako bi se potvrdilo genotip embriona, potrebna je prenatalna dijagnostika. Rekombinacije hromozoma u 1. miotičkoj podjela može uzrokovati pogrešna dijagnoza. U većini centara obavlja embriona biopsija, koja može otkriti bolest, naslijedila od bilo kojeg roditelja. Biopsija materijal obično se dobiva u koraku drobljenje zigota (korak osam ćelija) odabir ćelija 1-2. Zbog poteškoća koje se odnose na dijagnozu na tako ograničenom materijala (vidi. Ispod), idealno bolje biopsija blastocista, jer sadrži i do 300 ćelija. Osim toga, biopsija može se uzeti trofoblasta ćelije, jer su lako dostupni i ne ometa pravilan razvoj embrija. Međutim, blastocista biopsija se provodi ne u svim centrima zbog složenosti svog uzgoja ćelija u kulturi i smanjen opstanak blastociste nakon krioprezervacije. Međutim, koristeći ove metode, to je moguće postići trudnoću, a tokom vremena, sa iskustvom, njihova efikasnost je vjerojatno rasti.

Materijal koji se dobija na biopsiju, analizira jedan od dva načina: PCR ili fluorescentne hibridizacije in situ. Laboratorija obavljanje tih testova moraju imati potvrdu u svom izvještaju ukazuje koji način je korištena, kao i rezultat dekodiranja rezultata. Ipak, specijalista plodnosti je izuzetno važno razumjeti molekularne i genetske metode prijemplantacionog genodiagnostic, njihove aplikacije i njihove inherentne nedostatke.

PCR

PCR je najpogodniji za dijagnozu monogenskih zabolevanij koristiti da se odredi pol embriona je također, iako to će sada sve više koriste fluorescentne hibridizacije in situ. Za identifikaciju PCR mutacijom u određenom genu, potrebno je prije IVF da znam šta da traže mutacije, i pred-izaberite uvjetima reakcije. U svakom reakcija moraju biti uključeni u odgovarajuće pozitivne i negativne kontrole, u suprotnom rezultati se ne može vjerovati. Ne smije se zaboraviti da je tokom reakcija može biti niz izazova, uključujući:

1. odsustvo PCR proizvoda;
2. uzorak kontaminacije;
3. gubitak alela.

Osim toga, u mnogim centrima, ako planirate da se prijave za preimplantaciona dijagnostičke PCR su pribjegli Ubrizgavanje sperme, kako bi se izbjegle eventualne greške u dijagnozi uzrokovane uvođenjem transparentne plašta dodatnih sperme.

S obzirom da je broj prijemplantacionog genodiagnostics predloška DNK PCR nije dovoljno - obično nekoliko picograms, dok je normalno u PCR stotina nanograma se koriste, potrebno je povećati broj pojačanja ciklusa. Ako PCR DNK uzeta iz jedne ćelije (ili više ćelija) često zahtijeva 35-60 ciklusa, dok je standardna PCR (kada se iznos uzorak nije ograničavajući faktor) - oko 30. Drugo rješenje je da se PCR sa ugnježdene prajmera (ili jedan ugnježdene prajmer): dva uzastopna reakcije za pojačavanje malih količina ciljne predloška. U posljednjih nekoliko godina, koristili smo prajmera sa fluorescentnim oznaka za analizu vrlo male količine DNA, čime se poboljšava osjetljivost PCR je oko 1000 puta i na taj način smanjiti broj pojačanja ciklusa.

Da biste uklonili kontaminacije uzorka treba biti vrlo pažljivo pripremljena i reakcija smjesa drži reaktsiyu- toga, u reakciji uključuju negativne kontrole (reakcija mješavina koja sadrži sve sastojke osim DNK). Ako se otkrije negativnu kontrolu PCR proizvoda, mogućnost kontaminacije uzorka strane DNK - u ovom slučaju, PCR rezultat u ostatku uzoraka ne može vjerovati. Budući da je korištenje prajmera sa fluorescentnom broj etiketa PCR ciklusa manje šanse od kontaminacije uzorka ispod.

Gubitak alela znači da pojačani u osnovi jedan od alela, dok je drugi pojačalom vrlo slabo ili ne pojačan na svim. Naravno, ovo je najveća vrijednost u otkrivanju bolesti s autosomno dominantna bolest. Ako je "izgubio" dominantni alel sadrži mutaciju, greška u analizi može dovesti do transfera embrija u šupljinu maternice sadrži mutirani gen. Možete istovremeno pojačati različitim usko raspoređene DNK fragment koji imaju visok stupanj polimorfizma (višestruki PCR) U cilju da se zaobiđe ovaj problem. Osim toga, kao što je već spomenuto, možete poboljšati osjetljivost PCR pomoću prajmera sa fluorescentnom oznakom.

Udruženje prijemplantacionog genodiagnostics Evropske grupe za humanu reprodukciju i embriologiju (ESHRE) je ocenio dijagnostička točnost PCR i fluorescentne hibridizacije in situ. Prema godina 1999-2001., U 81 prijemplantacionog genodiagnostic slučaju, nakon PCR je izvedena pomoću prenatalni ili postnatalni diagnostika- pri čemu je greška u dijagnostici bolesti naslijedila u Mendelovski zakona otkrivena u 5 slučajeva (6,2%). Ponovljeno dijagnostike za potvrdu rezultata izvršena je samo polovina prijemplantacionog dijagnoze. Također je potrebno uzeti u obzir slučajeve u kojima nije bilo moguće izvršiti biopsiju ili nemoguće za dijagnozu.

Fluorescentna in situ hibridizacija

Ova metoda se sastoji u tome što se sonda (single-DNK) nosi fluorescentna oznaka, hibridizuje DNK iz denaturisano metafaza ploča, pojedinačne ćelije ili tkiva. metoda se može koristiti u prijemplantacionog gena dijagnostika za:

1. embrion seksati za X-vezana bolesti, ne postoji mogućnost da se izvrši PCR;
2. otkrivanje kromosomske translokacije;
3. otkriti promjene u broju hromozoma;
4. otkriti druge kromosomske abnormalnosti, kao što aneuploidije.

U studiji aneuploidije o mogućim tehničke poteškoće u vezi s definicijom broja hromozoma. Ako za analizu pojedinačnih međufazne ćelije su uzeti, teško je precizno odrediti broj signala (drugim riječima, hromozoma) kada issleduesh jednu ćeliju. Ako vidite samo jedan signal, to može značiti monosomiju na ovom hromozoma, ali i preklapaju signale ili da je sonda hibridizacije sa jednim od hromozoma nije uspjelo. Slično tome, prisustvo tri ili više signala može značiti trisomije, ali može biti zbog tehničkih problema: dvoslike signala ili nenormalan fluorescencije. Da se proširi mogućnosti dijagnostike može istovremeno primijeniti najmanje tri sonde: na X-kromosom Y-kromosoma i autozoma jedan primjer 18. kromosoma. U ovom slučaju, laboratorija treba uvijek biti strogo nadzirati kvalitetu hibridizacije na dijagnostičku preciznost je kao visok kao moguće, jer je poznato da se u studiji od 100 normalne diploidne ćelije 100 parova signala za svaki kromosom neće moći dobiti. Dijagnostičke mogućnosti će se proširiti, da li će biti moguće analizirati veći broj ćelija.

U ovoj metodi detekcije translokacija najčešće koriste sonde bočni translokacija ili zahvata poziciju. Od odmah nakon pripreme za IVF oocita polarnog tijela sadrže kondenzirani metafazi kromosoma sonde mogu se koristiti za "sliku" hromozomima u kombinaciji sa centromerni sonde na porcije (alfa satelita ponavljanja) i određenih lokusa. Nažalost, ćelije iz dekolte fazi zigota ili u fazi blastociste, kao sonde su neprikladne jer hromozoma ne mogu biti u metafazi i nedovoljno spojene. Metoda u kojoj se koriste sonde za subtelomeric regije kromosoma specifične kromosomske translokacije javlja između njih, i centromerni sonda dio, proksimalno u odnosu na mjesto translokacije. Takve sonde može otkriti u medjufaznu ćelijama dekompenzirano translokacija, ali ne može razlikovati između normalnog hromozoma od kromosoma translokacije sa kompenzovanom.

Prema izvještaju Udruženja za prijemplantacionog genodiagnostics Evropske grupe za humanu reprodukciju i embriologiju, fluorescentne in situ hibridizacije dao pogrešan rezultat u 8 slučajeva 145, kada je nakon dijagnoze prijemplantacionog koje prenatalna ili postnatalni (5,5%). Među pogrešne dijagnoze - dva slučaja trisomije, jedan mozaik trisomija, monosomiju i jedan kompenzirati i dekompenzovana translokacije. Osim toga, studija o aneuploidije je neotkrivena trisomija 21 hromozoma. Kao što je slučaj sa PCR potvrdu fluorescentne in situ rezultata hibridizacije je izvedena u manje od polovine žena koje su prošli prijemplantacionog gen dijagnostike.

Uloga fluorescentne in situ hibridizacije u određivanju translokacije danas nije jasno, jer 50-70% slučajeva, u kojima su roditelji nosioci kompenzirati recipročne translokacije, kada su embrioni dekompenzovana studija translokacija. Ovi objavljeni podaci o učestalosti uspješne trudnoće nakon studija znatno variraju, ali prema podacima od tri glavne centara učestalost trudnoće u smislu uzimanja jedno jaje je 29%. Neki autori prijavio da prijemplantacionog gen dijagnostika smanjuje rizik od spontanog aborta- ali nije jasno da li povećava stopu uspješnog završetka trudnoće u usporedbi s prirodnim začeća, jer je više od polovine embrioni imati abnormalnosti, a time i češće, u svakom slučaju, neće preživjeti. Uprkos činjenici da prijemplantacionog gen dijagnostiku za testiranje aneuploidije je više puta koristiti sa IVF, nijedan od objavljenih randomiziranih prospektivnih studija pokazala značajan porast u broju uspješan ishod trudnoće. IVF sa prijemplantacionog dijagnozom - invazivna i skupa procedura, tako da je važno da se precizno razgraničiti praktičnu ulogu ove metode.

Udruženje za prijemplantacionog genodiagnostics Evropske grupe za humanu reprodukciju i embriologiju

Izvući pravih zaključaka iz rezultata prijemplantacionog genodiagnostic provodi PCR i fluorescentne hibridizacije in situ, u praksi, to je još uvijek nije uvijek moguće. Prema izvještaju Udruženja za prijemplantacionog genodiagnostics Evropske grupe za humanu reprodukciju i embriologiju za dvogodišnji 1999- 2001., Sprovedena u 1197 ECO ciklusa kao što pokazuju rezultati kasnijeg prenatalna ili postnatalni dijagnoze, prijemplantacionog gen dijagnostiku pomoću PCR dao pogrešan rezultat u 5%, a uz upotrebu fluorescencije hibridizacije in situ - 6% slučajeva. biti cijenjen da je nakon dijagnoze izvode manje od pola vremena, tako da je broj pogrešnih dijagnoza može biti preniska. Međutim, ovi podaci ne znače da je u 94% slučajeva je napravljena pravilno dijagnozu. Prema pridruživanju, ukupna stopa trudnoća nakon berbe jaja bio je 17%, a biopsija je bio uspješan u 97% slučajeva, dijagnoze i moći zadržati samo 86% slučajeva. Sve u svemu, to znači da je ispravan dijagnoza prijemplantacionog dijagnoza je postavljena oko 85% slučajeva. Oni koji su o tome da se podvrgne prijemplantacionog gena dijagnostike, treba upozoriti da je u 15% slučajeva, ispravna dijagnoza ne može postaviti.