Terapija-efekt gena odgovornih za sintezu proteina aktina i srčanih distrofina na razvoj hronične srčane insuficijencije kod pacijenata sa dilatacionom kardiomiopatija infarktom miokardai

DDa bismo razumjeli mehanizmi razvoja i progresije neuspjeha hronicheskoyserdechnoy (CHF) Istraživanje poslednihlet fokusira na procjenu doprinosa genetskih faktora vrazvitie cirkulacije neuspjeh. Perspektivnympodhodom To je zbog činjenice da se otkrije genetski rizik i proiskhoditprognozirovanie komplikacija bolesti do njihovog klinicheskihproyavleny [1, 2]. Tako je, trenutno na molekularnoj patogenezi kardiomiopatija urovnerassmatrivaetsya kao proiskhoditnarushenie u procesu ekspresije gena, posebno mehanizmovpretranslyatsii, prijevod i posttranslyatsii koja dovodi do izmeneniyufenotipa [2]. Poznati rad za identifikaciju genetske faktorovrazvitiya CHF kod pacijenata sa dilatacionom kardiomiopatija (DCM), posebno u ovih pacijenata otkrio mutacije na različitim uchastkahgenov odgovoran za sintezu distrofina proteina i aktin [3, 4,5, 6].
Nema objavljenih izvještaja o mutatsiigena distrofina, i aktin u bolesnika s infarktom miokarda, hotyamozhno pretpostaviti da je slična mutacija je moguća pod vliyaniemstressa i neurohormonalnih mehanizama aktivacije.
U tom smislu, cilj rada je issledovaniegenov aktin i distrofina u bolesnika s idiopatskom dilatativnom kardiomiopatija, uy osobe sa infarkta miokarda.

Materijali i metode

U issledovanievklyucheno 130 pacijenata, uključujući i 104 muškaraca i 26 žena, vozrasteot 21-88 godina. Pacijenti su bili podijeljeni u tri grupe: 1. GROUP- macrofocal i bolesnika s akutnim transmu- infarkt miokarda, komplikovano CHF II - IV FC po NYHA, 2. grupa - s infarktom miokardabez klinički znaci zatajenja srca, 3. grupne pacijenata s idiopatskom dilatacionom kardiomiopatija CHF II - IV FC. Kontrolyasostavilo grupi od 30 ljudi, uključujući 21 muškaraca i 9 žena, vozrasteot 25-76 godina (srednja dob 55,5 godina) bez kardiovaskularnih sosudistoypatologii i bez teških hroničnih bolesti.
Kliničkih i demografske karakteristike bolnyhpredstavlena stola.
Studija gena aktina i distrofina proizvodilosv Institut za opštu genetiku, laboratorijske i radiatsionnoygenetiki okoliša Instituta za biologiju RAS gena.
tselnayakrov je korišten za ekstrakciju DNK, uzeti u epruveti s EDTA na konačnu koncentraciju 50mMili citrat sa završnim koncentraciji od 0,5%. Izolacija DNK provodilis pomoću "DiatomTMDNA Prep 200" reagens kit (proizvođača "Biokom"). Osnovu DNA izolacije koriste ovaj naboralezhit korištenje rasvjeta reagensa za DNK guanidintiotsionatomi apsorbent "nukleoz". U prisustvu visokih koncentracija guanidintiotsionata (4M) DNK adsorbira na aktivnoj površini čestica "nukleoz", a preostalih komponenata krvi ostane u mediju, koji je tada udalyayutsyatsentrifugirovaniem. DNK oprati spirtosolevym tampon zatemsmyvaetsya extragenic sorbenta sa mješavinom jonskih izmjenjivača i za postavljanje reakcije napryamuyuispolzuetsya polimeraze (PCR) Izolacija DNA iz pune krvi provedena u skladu s nizom instruktsieyispolzovannogo "DiatomTMDNA Prep 200" "Biokom" firma.
Za detekciju mutacija u metodi gena kardioaktinaispolzovali PCR-RFLP, PCR proizvoda pri čemu ograničenje rezhetsyasootvetstvuyuschey enzima, prepoznaje interesantnoj nukleotidnuyuzamenu. Uz ograničenje enzim Bcl I ograničenje stranice (-TGATCA-) vyyavlyaetmissens mutacija G (norma) do A (mutacija) otopljen u 5-eksonu gena kardioaktina povezani s idiopatskom dilatativnom kardiomiopatija. Sintezpraymerov za istraživanje 5. eksonu je kardioaktina drži sintisajzer PE Applied Biosystems (SAD). Sastav kapisle: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R 5 / -gatctcccactcacaaaag.
PCR amplifikacije je izvedena na sljedeći način rezhimeamplifikatsii: 950S - 40, 580S - 30, 740S - 40 na 30 ciklusa.
Veličina pojačan fragment 222 parynukleotidov. Konačna koncentracija PCR reakcije smeše: 67 mMTris HCl c pH = 8,8, 16 mm (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20.1 jedinice. Taq.polimerazy, 200mm dNTP svaki, 0,5 mM svakog prajmera 10-20ng DNK istraženi, 1,5 mM MgCl₂,konačna količina PCR mješavina od 30 ml.
Da bismo analizirali pojačanje Rezultati 10 mklPTsR proizvod je primijenjena na 2% agaroznom gelu. vgele DNK razvijen Ethidium bromid pod UV svjetlom dužine vala 32nm. Nakon vizualne ocjene PCR koncentracija proizvod opredelyaliobem PCR mješavina potrebno za postavljanje ograničenja reakcije (5 do 10 l PCR mješavina).

Istraživanje distrofina gena

Za obnaruzheniyamutatsii u distrofina gena PCR metoda sa sikvensspetsificheskimipraymerami (PCR-SSP), pri čemu ispolzuetsyapara za PCR prajmera, od kojih jedan sadrži jedan ili dva tochechnyezameny. Jedan od supstitucija je zanimljiva zamjena tochechnuyunukleotidnuyu. Princip metode je da je temperatura prioptimalnoy bodljikava prajmera u odsustvu mutacija pojavljuje specifičan bend proizvoda PCR, au slučaju mutatsiipri istoj temperaturi i žarenja prajmera amplifikatsiine reakcija teče. Izabrane dva para sikvensspetsificheskih praymerovprednaznacheny otkriti missenns mutaciju A do G u 9. ekzonegena distrofina normalnog slijed i mutacija sootvetstvennosvyazannaya sa X-vezana idiopatske dilatativnom kardiomiopatije.
Sinteza kapisle za istraživanje 5. ekzonakardioaktina je izvedena na sintisajzeru PE Applied Biosystems (SAD).
Sastav prajmera: DN 5-gta aat GTT GAC aga cctgtg 5-gaa CCT CTC TCG CAG ATC ACG Dm 5-gta aat GTT GAC aga cctgtg 5-RGZ TCC TCT CTC OKU gat CGC a
PCR amplifikacije je izvedena na sljedeći način rezhimeamplifikatsii: 950S - 40 s, 560C - 30, 740S - 40 za 35 ciklusa.
Veličina pojačan fragment 160 parnukleotidov. Konačna koncentracija PCR reakcije smeše: 67 mMTris HCl c pH = 8,8- 16 mm (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20.1 jedinice. Taq polimeraze, 200mm dNTP svaki, 0,5 mM svakog prajmera 10-20ng DNK istraženi, 1,5 mM MgCl₂,konačna količina PCR mješavina od 30 ml.
Tabela. Klinički i demografske karakteristike pacijenata.

Da bismo analizirali rezultatovamplifikatsii 10 ul PCR proizvoda je primijenjena na 2,5% agaroznom gelu pokazala elektroforez.DNK gel sa Ethidium bromid pod UV svjetlom dugo volny320 nm.
Da otkrije mutacija u issleduemyhprobah snimljene amplifitsirovannogofragmenta prisustvo ili odsustvo odgovarajuće par primera:
1. prisutnost PCR fragment od 160 parova nukleotidovpri pojačanje prajmer par za normalno posledovatelnostiukazyvaet na norma.
2. Odsustvo PCR fragment sa 160 parnukleotidov pojačanje prajmer par za normalnoyposledovatelnosti ukazuje na prisustvo namjeravanog mutacije.
3. Prisustvo PCR fragment od 160 parova nukleotidovpri pojačanje prajmer par za mutatsieypodtverzhdaet sekvence sa mutacije.

Rezultati i diskusija

Kao što je spomenuto, u literaturi nema izvještaja o mutacija distrofina gena iaktina kod bolesnika sa koronarnom bolesti srca, posebno sinfarktom infarkta, iako pod uticajem neurohormona i drugih biologicheskiaktivnyh supstance, koje se aktiviraju kao odgovor na povrezhdenieserdechnoy mišića (u ovom slučaju, infarkt miokarda), vozmozhnopredpolozhit sličan mutacije. Međutim, bez obzira na uvjete pravilnyeteoreticheskie i naša očekivanja, mutacija gena ispitivanih pacijenata nije pronađeno. Osim toga, ne opredelyalasmutatsiya i kod pacijenata sa dilatativnom kardiomiopatija, iako je u posljednjih nekoliko godina u istraživanju rezultateryada dobiti dovoljno značajne rezultate, zbog kotoryekasayutsya distrofina genske mutacije i aktin sa srcem nedostatochnostyu.V Konkretno, R. Ortiz-Lopez et al. [2] istraživali genomnuyuDNK 3 nepovezane obitelji s X-vezana dilatacionom kardiomiopatija.Kontrolna skupina sastojala od 50 ženskih osoba i 50 muških neyavlyayuschihsya rođaka. Za pojačavanje DNK je korišten PTSR.V rezultat istraživanja u jednom od porodice sa X-vezana DKMPbyla identifikovani genske mutacije kodiranje distrofina lokalizuyuschegosyav hromozoma 21, posebno, pronašao zamjenu adenin guaninv egzona 9 na poziciji 1043, što je dovelo do sinteze hidrofobnih nepolyarnoyaminokisloty alanin umjesto hidrofilnih polarnih treonin prisutni u distrofina na poziciji 279, koje se tiču KN-terminus proteina distrofina. Zamjena treonin od alanina izmeneniyupolyarnosti dovodi do N-terminus proteina i stoga promjenu vtorichnoyi distrofina tercijarne strukture. Dakle, ovo mutatsiyayavlyaetsya dovesti do gubitka stabilizaciju membrane poremećaja funkcije etogobelka i funkcionalna aktivnost kardiomiocitima, chtoi dovodi do X-vezana degenerativne bolesti miokarda- X-vezana dilatativnom kardiomiopatije.
F. Muntoni et al. [4], i Milasini J. et al. [5] su opisane mutacije u drugim lokacijama distrofina.Eti gena porcije su ispitivani R. Ortiz-Lopes et al. [3] tehzhe 3 obitelji sa X-vezana dilatativnom kardiomiopatije, mutacije na ovim stranicama su vyyavlenone. Shodno tome, ne možemo misliti o razvoju distrofinopaties različitih mehanizama veduschihk.
Prema tome, bilo mutacija distrofinaprivodit na nedostatak infarkta proteina koji yavlyaetsyaprichinoy odsustvo infarkta distrofinassotsiirovannyh glikoproteina [7, 8] odgovoran za vezivanje kompleks multiproteinnogo sbelkami ekstracelularnog matriksa. Rezultat ove yavlyaetsyadezorganizatsiya kardiomiocitima, što je dovelo do promjene u mehanicheskoymodeli miokarda, poremećaj njene pumpanje funkcije i zatajenja srca.
Što se tiče mutacija srčanog aktina, druže 1998. godine objavio rad T. Olson et al. [6] pokazuje studija dvije nepovezane semeys autosomno dominantno idiopatska kardiomiopatija (jedan semyanemetskogo porijekla, drugi - švedsko-norveški). Za vsehchlenov koje ehokardiografija, biopsiyamiokarda, DCM identificirati karakteristične crte (žarišna interstitsialnyyfibroz i hipertrofiju kardiomiocita). Za otkrivanje mutacije gena aktina PCR je korištena. dva odvojena mutatsiietogo gen identifikovan: jedna - u 5. egzona kardioaktina gena (zamjena guaninana adenin, što dovodi do kodiranja sintezu histidina u 312 mpolozhenii umjesto arginina), a drugi - do 6. egzona (zamjena adeninana guanin, što je rezultiralo pojavio sinteza 361-poziciju glutamina glitsinavmesto). Ali, da ove promjene mogu smatrati vramkah kardioaktina polimorfizam gena. Da biste izuzeli kao što predpolozheniyaprotestirovany 435 nepovezanih ljudi opisani mutacija nije ih vyyavlenou. Prema tome, te oličenje assotsiiruyutsyaimenno aktin gena sa idiopatskom dilatativnom kardiomiopatija.
Činjenica da je naš rad nije bilo moguće utvrditi mutatsiyagenov aktin i distrofina nije direktno izjavu da mutacija nije. Možda je mutacija javlja vbolee kasnijim fazama bolesti? Treba napomenuti da je u nashemissledovanii ne vodi genetske analize u obitelji s idiopaticheskoyDKMP i nepovezane ljudi su odvedeni. Vjerojatno za glubokihvyvodov također potrebna velika populacija u smislu issledovanie.I ne može biti manje smisla studija gena drugihstrukturnyh komponente srčanog mišića, posebno kollagenai elastina mutacije koje mogu imati vrijednost u razvitiiHSN.

reference:
1. Tereschenko SN Clinicopathogenetic genetski aspekti hroničnog zatajenja srca ivozmozhnosti korekcije droge. / Diss. ... Dr. med. nauk.- M. 1998- 287.
2. Bristow M.R. Zašto miokarda ne? Uvidi iz osnovne nauke. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R., Li H., Su J., Goytia V., Towbin J.A. Dokazi za distrofina missensemutation kao uzrok X-vezana dilatativnom kardiomiopatije. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F., Cau M., Ganau A., Congiu R., Arvedi G., Mateddu A., Marrosu M.G., Cianchetti C., Realdi G., Cao A., Melis profesionalan umjetnik Kratki izvještaj: brisanje distrofina mišića promoterregion povezane sa X-vezana dilatativnom kardiomiopatije. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasin J., Muntoni F., Severini GM, BartoloniL., Vatta M., Kraoinovic M., Mateddu A., Angelini C., CameriniF., Falaschi A., Mestroni L., Giacca M. i HMD Study Group . Apoint mutacija u 5` spoja sajtu distrofina gena firstintron odgovoran za X-vezana dilatativnom cardiomyopathy.// Hum.Mol. Žene. 1996- 5: 73-9.
6. Olson T.M., Michels V.V., Thibodeau S.N., Tai Y.S., Keating M.T. Aktin mutacije u dilatativnom kardiomiopatije, a nasljednu formu zatajenja srca. // Science. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R.D., Maeda M., Roberds Š.L., HolderE., Bohlmeyer T., Young J.B., Campbell K.P. A 5` distrofina duplicationmutation uzrokuje membrana nedostatak alfa-dystroglycan u Afamily sa X-vezana kardiomiopatije. // J. Mol. Ćelije. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W.M., Cremer M., Herrmann R., GrunigE., Fogel W., Scheffold T., Goebel H.H., Kircheisen R., KublerW., Voit T. et al. X-vezana dilatativnom kardiomiopatije. Roman mutationof je distrofina gena. // Ann NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.