Polarizacija metoda fluorescencije antitijela. korelacija imunoglobulina

Da se pozabavi pitanjem postojanja nezavisne rotacije podjedinice imunoglobulina velika pomoć je metoda fluorescencije polarizacije. Osnovni pristup koji je korišten u ovim eksperimentima za proučavanje imunoglobulina fleksibilnosti sastojao u u odnosu na eksperimentalno određena vremena korelacija imunoglobulina molekula, našao u eksperimentu karakterišu vremenski molekula ravni polarizirano svjetlo, s vremenom korelacije izračunat na pretpostavci da je krutost molekula.

Dakle, ako pretpostavimo da je molekula IgG kruta elipsoid ose rotacije s omjerom 1: 2 i molekularne težine od 150.000, vrijeme korelacija molekula mora biti jednak 73 nsec, i eksperimentalno primetio, to je obično znatno manji: 20-40 nsec. To ukazuje na sposobnost fragmenata nezavisnoj relativnog pokreta, a time i fleksibilno povezivanje dijelovima polipeptidnih lanaca. Slični podaci su dobijeni spin oznaka.

Štajerska i Griffith (Stryer, Griffith, 1965) za određivanje vremena korelacija spin oznakom Hapten vezan za antitijela, proučavali ponašanje materije koje sadrže oba grupu Fluorohromno, oznaku spin i različita rješenja viskoznosti.

Promjenom viskoznosti rastvor dodavanjem glicerol, ostvarila svoj EPR spektar odgovara sa spektrom spin-oznakom Hapten vezan za aktivne stranice. Zatim, metoda fluorescencije polarizacije određena je vremena korelacija. Tako je našao vremena korelacija N-O grupa povezana spin-označeni Hapten je utvrđeno da je 12 nsec. Autori ispravno imajte na umu da ta vrijednost može biti previše niska u odnosu na vrijeme korelacija Fab-fragment, jer se ne može isključiti mogućnost rotacije prstena u odnosu imminoksilyyugo dinitrophenyl grupa, čvrsto povezan sa aktivnim centar. Ovaj nedostatak je zajednički za sve pokušava da odredi vrijeme korelacija IgG Fab-fragment pomoću spin-oznakom Hapten.

">

Hsia i Piette (Hsia, Piette, 1969) za određivanje vremena korelacija u vezi sa aktivnim centar spin-označen Hapten, kalibracija ovisnost o viskoznosti EPR spektar spina oznaka rješenja. Korelacija vremena odgovara određenom opsegu, određuje Stokes 'zakonu - Einstein, s obzirom da je efektivna Stokes radijus znaka je 5 A. Najkraći spin-označeni Hapten najčvršće vezani za aktivno mesto, imali korelaciju vremena od 39 nsec.

Dweck et al (Dwek e. a., 1975A) izračunati vrijeme korelacija spin-oznakom DNP lokaliziran u aktivni centri IgA (MOPC 315) i Fab- i FV-fragmsntov. Utvrđeno je da je 44,4, 23 i 6,5 nsec, respektivno.

dobiti zec antitijela direktno protiv spin oznaka 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-amino (N-dichlorotriazine) služi imunizacije sa Hapten. Rezultat formiranja posebnih kompleksa antitijela, i peptički fragmenti papannovyh sa etiketom spin ima jak imobilizacije. Miješanje odgovarajuće količine rješenja nespecifičnog zec IgG i etiketama sličnim uvjetima rezultiralo samo u izgledu EPR spektra slobodnog oznaka. Vrijeme korelacija oznake izračunava Shimshiku i McConnel (Shimshick, McConnell, 1972). utvrđeno je da je 32, 30 i 18 nsec odnosno za komplekse spin etiketa sa antitijela, FC- i Fab-fragmenata u izoelektrične tačke (pH 6.3).
Dobijenih vrednosti vremena korelacija IgG Fab-fragmenata i potvrđeno u navode novine.

Razlike u vremenu korelacija, dobila za Fab-fratmenta kao izolirani i dio F (ab) 2 i netaknuta antitijela ukazuju na ograničenja slobode rotacije Fab-fragmenata, podjedinice koje nameće reaguje F (ab) 2 i IgG. Povećanje temperatura rezultirala je smanjenjem svodi na standardne uvjete (3 * 105 P / ° C), vrijeme korelacija oznake kompleksa sa F (ab) 2 i IgG.

Navodno, kada grije sloboda relativno se kreću podjedinice povećava. Mogućnost dobijanja antitijela na spin etiketu, služio imunizacije sa Hapten je potvrđeno u drugoj studiji (Humphries, McConnell, 1976).