Krv radioimunoeseja (RIA) aplikacija

Godine 1956. oni su prvi put otkriven u pacijenata liječenih inzulinom, nepretsipitiruyuschie antitijela sposobna vezivanja ¹³¹I-insulin. Zatim, ova istraživačka grupa je pokazala da neoznačenih inzulina natječe sa oznakom antitela za vezivanje i potiskuje ga iz imunog kompleksa. Nakon toga, Berson i Yalow razvio prvi metoda za RIA mjerenje koncentracije inzulina u serumu, za koju su dobili Nobelovu nagradu. U ovoj metodi, insulin vezana za antitijela je odvojena od nevezane insulin papir elektroforezom. Otprilike u isto vrijeme, u 1960., Grodsky i Forsham opisuju slične metode pomoću RIA ¹³¹I-insulin, ali odvajanje vezanog i nevezanog hormona, oni umjesto soljenja elektroforeza je korišten.

Ogroman doprinos razvoju RIA Hales i Randle je 1963. godine za odvajanje vezanog i nevezanog hormona su koristili anti-y-globulina, takozvane sekundarne antitijela. Ovaj pristup se zasniva na radu Skom i Talmadge, koji je 1958. godine pokazala je da sekundarna antitijela izazvati taloženje kompleksa "antigen-primarna antitijela." Hales i Randle način, naziva "metodom dvostrukog antitijela", pokazalo se da mnogo više osjetljiv i specifičan od prethodnih verzija RIA.

1963. godine, Herbert et al. Razvili smo tehnike za razdvajanje kompleksa "antigen-antitijelo" iz nevezanog antigen od aktivnog ugljena obloženog dekstran. Metoda se zasniva na imovinu ugalj dekstran mješavina znatno momentalno apsorbirati slobodan antigen bez vezivanja uz antigen-antitijelo kompleksa. Ova tehnika omogućava da se odvoje imuni kompleksi mnogo byst7 Yardarm od tehnike pretsipitatsionnye, tako da ga možete koristiti ¹³¹I-antigeni sa niskim specifična aktivnost označeni Hunter i Greenwood.

Video: Naučite crtani Winx?

Istovremeno Utiger et al. proširio opseg primjene RIA, razvijanje metoda za kvantifikaciju ljudski hormon rasta. Kasnije Greenwood et al. implementirana metoda iodination STH, omogućavajući da se dobije označen hormon uz specifična aktivnost 200- 500 mCi / mg (6000-9000 Ci / mmol).

Ova tehnika se i danas koristi. Njegova suština je u tome da je izotopa joda (1311 ili 1251), u sastavu natrijev jodid se oksidira hloramin T i u ovom obliku zamjenjuje jedan ili više atoma vodonika u fenil prsten tirozina i histidina imidazola prsten. Nakon 1 min, reakcija smjesa se dodaje redukcijsko sredstvo, da bi se izbjegla nepotrebna oštećenja hormona. Imajte na umu da je opisan princip oksidativnog iodination proteina u Hughes 1957 u daljem Meyer Knobil i razvijen za RIA mjerenje majmuna i ljudskog hormona rasta, pri čemu je aktivni ugljen koristi za odvajanje nevezanog hormona.

Porijekla RIA za mjerenje nivoa GONADOTROPNIH hormona (u ovom slučaju - LH), razvijen 1966. godine, na zasniva na korištenju antitijela na ljudski CG, jer je ranije pokazano da su antitijela se vežu za ljudske i LH. Jedan od eksperimenata u ovom području je napravio pravu revoluciju u imunohemijski: Catt et al. Otkrili smo da antitijela su u stanju da se pridržavaju diskovi diazotized polistirena. Tako, eliminirajući potrebu za odvajanje kompleksa antigen-antitijelo kompleks padavina ili adsorpcije. Kasnije Catt et al. naučio imobilisani antitijela direktno sa nezasićenim stiropora u alkalnom mediju. Rezultati ovih istraživanja poslužili su kao osnova za stvaranje ELISA (vidi. Dolje). Faiman i Ryan po prvi put uspio serum na hipofizi gonadotropina - ljudski LH. Nakon toga RIA za određivanje pacova LH su razvijeni.

Razvoj RIA za mjerenje razine FSH, kao u slučaju LH, početi sa okom na buduće kliničkih istraživanja. 1967. i 1968.. nekoliko istraživačkih grupa su izvještavali o novim metodama RIA za različite oblike ljudskog FSH. Svi oni su metodom dvostrukog antitijela.

1967. godine, Aria i Lee po prvi put najavio način utvrđivanja prolaktina, metodom dvostrukog antitijela. Prvi mjerenje nivoa prolaktina RIA su provedene u nedostatku ljudskog materijala u ovaca i goveda plazmi.

Teorijske osnove RIA

Prva metoda RIA (npr metode Berson i Yalow ili Grodsky i Forsham) su na osnovu fenomen konkurentne inhibicije. Ovaj fenomen se sastoji u tome da je vezivanje izotopa-oznakom hormona (tragač antigen) sa specifičnim antitijela inhibira u prisustvu neoznačeno hormona (neoznačena antigen). Fenomen konkurentne inhibicije se može opisati dva jednadžbe: 'oznakom antigen + antitijelo kompleks nosi oznaku "i" neoznačeno antigen + antitijela <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Obično RIA nastupio na 4 ili 37 ° C, u fosfat-puferiranoj fiziološkoj otopini pri pH 7 ili 8. reakcija može trajati od 2 do 24 sata (zavisno od afiniteta antitijela i željeni nivo osjetljivosti). Imajte na umu da automatizacija analize i poboljšanje metoda za proizvodnju antitijela značajno smanjuje vrijeme reakcije. Kada je reakcija smjesa, ravnoteža je uspostavljena, antigen-antitijelo kompleksi su razdvojeni padavina sa srednjom antitijela, antigena i apsorpcije slobodnih antitijela na aktiviranim ugljenom ili padavina u srednje visoke gustoće kao što je polietilen glikol. Ako je čvrste faze RIA, inkubacije medij se jednostavno ukloniti i antigen-antitijelo kompleksi ostaju na polistiren ili druge čvrste faze. U posljednjem koraku radioaktivnost kompleksa. Ako je hormon označen ¹²⁵I ili ¹³¹I, koristeći kontra-zračenja ako oznaku služio 3H, čestice koristeći scintilacioni brojač. koncentracija hormona u uzorcima izračunavaju se iz krivulje kalibracije pripremljen iz mjerenja u standardnim uzorcima s poznatim koncentracijama hormona.

Priprema antitijela

Poliklonska antitijela je pripremio imunizacije RIA antigena (hormona) životinje različitih vrsta, uključujući i zečevi, kokoši, zamoraca, patke, ovce i koze. Za primarni antitijela (anti-hormona) obično se koristi u kunića i zamoraca za sekundarnih antitijela (anti-primarni) - ovaca i koza.

Video: Alergije na psa mala rasa

Postoje mnogi načini imunizacije, najčešći - injekcije antigena u uložak za cipelu, ili u regionalnim limfnim čvorovima ili slezene. Budući da je u domaćinu antigena postoji za kratko vrijeme, za pouzdanu indukciju imunog odgovora pomoću Freund adjuvans. Non-imunogeni antigena niske molekularne težine (npr steroidnih hormona) i antigeni sa niskim imunogenost prije imunizacije vezan za velike molekule ili čestice (metil albumin, feritin, dekstran, Sephadex i m. P.). Imunizacija se uglavnom odvija u nekoliko faza u intervalima od 2 tjedna. Tipično, nakon nekoliko injekcija od titra antitijela u serumu rapidno raste. Krv za imuni serum uzeti iz šupljine srca ili vene i arterije uha. Potonji metoda se najčešće koristi u kunića. Rezultirajući serumu je inkubiran 30 minuta na 57 ° C da uništi dopuna. Zatim, serum se dodaje konzervans za sprečavanje rasta bakterija i gljivica (natrijumazid ili timerosal).

monoklonskih antitijela

1975. godine, Kohler i Milstein razvio potpuno novi - hibridoma - tehnologije za proizvodnju antitijela. Kasnije, ovakav razvoj je dobio Nobelovu nagradu. Mi opisati glavne elemente ove tehnologije.

Miševi ili štakori su vakcinisana sa antigena, kao što je hormon. Kada titar antitela u serumu dobiva dovoljno visoko u imuno životinja iz sela Zenk izolovane plazma ćelije među kojima su ćelije - proizvođač antitijela na početnu antigen. Plazma stanica in vitro hibridizovan mijeloma izvedena životinja iste vrste. Ćelijske suspenzije je prebačen u izbor medij u kojem samo hibrid ćelije prežive, i plazme i Nye mijeloma nestati. Hibridni stalak za jedan nosilac u bunare od klorovodične srednje feeder gdje su podijeljeni i oblik hybridomas (ovjekovječio staničnim linijama). Među pluralnost odabrati one hybridomas koje proizvode antitijela željene antigena i množite svoje hranjivu podlogu ili u peritonealnoj šupljini syngeneic miševa. Od pitatelno- srednji ili ascites tekućine izolovan antitijela. Ova antitela se nazivaju monoklonskih jer su proizvedeni od strane hibridoma su potomci jedne plazma ćelije. Monoklonskih antitijela proizvedenih od strane hibridoma, priznaju samo jednu epitop antigena. To je osnovna razlika između monoklonskih antitijela iz poliklonska antiseruma koje obično sadrži nekoliko različitih antitijela protiv različitih determinanti antigena.

Jedna od važnih prednosti monoklonskih antitijela na poliklonalnim leži u činjenici da je isti tip monoklonskih antitijela sa definisanim specifičnosti i afiniteta mogu biti proizvedeni u bilo kojoj količini i praktično beskonačno (kao što je besmrtna hibridoma). Nasuprot tome, sastav antitela poliklonskim serumima je veoma varijabilna, koji treba da se provjeriti svaku novu seriju antiseruma i izbor uslova njegove primjene. Prema tome, upotreba monoklonskih antitijela mnogo lakše standardizirati RIA i drugih imunohemijska testova.

Dobijanje hormona, radioaktivno

Kao što je već spomenuto, za jodiranja proteina hormona najčešće korištena metoda je predložio Greenwood i Hunter. U početku se koristi kao oznaka ¹³¹Sam, ali zbog kratkog vremena poluraspada ovog izotopa (8 dana) rok trajanja označen hormona bila mala. 1967. godine, Wilde et al. koristi za jodiranja ¹²⁵I (T_1/2 = 60 dana). Od tada, izotopa koji se koriste za označavanje bilo proteina, a neke ne-protein hormona. Tako dobiveni označeni hormona sa specifična aktivnost 100-250 mCi / mg. To je dovoljno za pouzdanu detekciju čestica u kontra zračenja.

Za označavanje ne-proteinski upotrebu hormona i drugih radioaktivnih izotopa kao što su radijatori čestice ³H ili ¹⁴C. označen ³H ili ¹⁴C steroidi se koriste ne samo u imunohemijske analizu hormona, ali i osnovnih endokrinoloških studije, na primjer za proučavanje lokalizacije steroidnih receptora u različitim ćelijama i tkivima eksperimentalnih životinja.