Laboratorijske dijagnostike zaraznih bolesti

Uobičajeni tipovi testova uključuju mikroskopija, test kulture, imunološki testovi (testovi aglutinacije, kao što su lateks aglutinacije, enzim imunoanaliza, Western blot, padavine ispitivanja i dopunjuju fiksacija testovi) i metode identifikacije nukleinskih i ne-nukleinskih kiselina. Obično je test kulture - je zlatni standard za identifikaciju mikroorganizama, ali rezultati možda neće biti dostupan za dana ili tjedana. Osim toga, patogena može izolovati u kulturi, što ih čini korisna alternativa testovima. Kada patogena obavlja test kulture, a to se identifikuje, laboratorija može procijeniti svoju osjetljivost na antibiotike.

Neki testovi (npr bojenje po Gramu, uobičajeni aerobne kulture) može otkriti širok spektar patogena. U isto vrijeme, neki patogeni se ne može ustanoviti u analizi. Stoga, kliničari trebaju biti svjesni ograničenja svakog testa za specifične mikroorganizama. U takvim slučajevima, liječnici bi trebalo pitati za testove koji su specifični za osumnjičenog patogen (npr posebne boje ili medij za kulturu) ili preporučiti određene laboratorijske testove na izbor.

mikroskopija

Mikroskopija može učiniti brzo, ali preciznost ovisi o iskustvu laboratorije radnika i kvaliteta opreme. Instrukcije često ograničavaju korištenje doktora mikroskopije za dijagnostičke svrhe je certificirani laboratoriji.

Većina uzoraka tretiranih boje da patogene boja koja ih čini se ističu iz gomile, iako se mogu koristiti mokrim pripreme neumrljan uzoraka za otkrivanje gljivice, paraziti, informativni ćelije iz vagine, mobilni organizmi (npr Trichomonas) i sifilis (mikroskopija, Darkfield ). Otkrivanje gljiva mogu popraviti pomoću 10% kalijum hidroksid da raspusti okolnog tkiva i ne-gljivičnih organizama.

Kliničar zatražio slika na osnovu vjerovatno patogena, ali ne bojenje nije 100% precizan. Većina uzoraka obradio gram bojenja, a ako se sumnja mikobakterija, kiseline-bojenje. Međutim, neki patogeni su teško vidjeti kada koristite ove metode. U takvim slučajevima zahtijevaju različite verzije za bojenje ili druge metode identifikacije. Od otkrivanja mikroskopski mikroba obično zahtijeva koncentraciju od oko 1h105 / ml, većina uzoraka biološkog tekućine (npr CSF), koncentriran (npr centrifugiranjem) prije analize.

gram mrlje. Gram mrlje klasificira bakterija prema tome da li zadržati kristal violet mrlja (gram-pozitivne - plavi) ili ne (gram - crveno). Osim toga, to pokazuje morfologiju ćelije (npr bacili, koke) i njegove organizacije (npr klaster lanac diploida). Takvih funkcija može pomoći u pred-izbor antibiotika dok se čeka na konačnu identifikaciju. Za proizvodnju Gram mrlje, laboratorijski materijal se grije i fiksni uzorak na slajdu, a zatim stained sekvencijalno sa Gramu ljubičasta, jod, aceton i kontrastne boje (obično Safranin).

Kiseline i umjereni (modificirani) kiselina boje. Takve boje se koriste za identifikaciju organizama, otporan na kiseline (Mycobacterium sp.) I umjereno otporan na kiseline organizama (posebno Nocardia sp.). Ove boje su takođe korisni za bojenje rodova Rhodococcus i slično, kao i oocisti nekih parazita (npr Cryptosporidium).

Iako detekciju mikobakterija u ispljuvka zahtijeva samo oko 5 000-10 000 mikroorganizama / ml, mikobakterija su često prisutna u ljudskom tijelu na nižim nivoima, tako da je osjetljivost je ograničen. Obično nekoliko ml ispljuvak deaktivirati natrij hidroksida i koncentrirana centrifugiranjem za kiseline bojenje. Ovo poboljšava dijagnoze, iako su neki umjereno otporan na kiseline organizmi su teško razlikovati od mikobakterija.

fluorescentno bojenje. Takve boje omogućavaju detekciju patogena pri nižim koncentracijama (1x10⁴ ćelija / ml). Primjeri - Acridine naranče (bakterije i gljivice), auramin rodamin i auramin O (mikobakterija) i kalkoflyuor bijele (gljive, posebno dermatofita).

Spoj u fluorescentnom bojom na antitijela usmjerena na patogena (direktno ili indirektno imunofluorescencija) povećava osjetljivost i specifičnost dijagnoze. Međutim, ovi testovi su teško čitati i interpretirati, i nekoliko (npr direktna fluorescencija testovi i Pneumocystis Legionella antitela) su komercijalno dostupni i obično se koristi.

bojenje tinte. Ova boja se koristi za otkrivanje uglavnom Cryptococcus neoformans i druge skrivene gljive u suspenziji oprane ćelija (npr CSF talog). U boji srednje domena, a ne samo telo, što ga čini moguće vidjeti bilo kapsulu oko tijela kao oreol. Za drugih patogena test nije toliko osjetljiva kao otkrivanje kriptokokalnog antigena. Specifičnost metoda je ograničena: bijela krvna zrnca mogu se pojaviti skrivena patogena.

Wright bojenje i Giemsa. Takve boje se koriste za otkrivanje parazita u krvi, Histoplasma capsulatum fagociti i tkivo, intracelularni Uključene formirana virusi i klamidija trophozoites od Pneumocystis jirovecii i određene intracelularne bakterije.

Trichromic bojenja (bojenje Gomori - Wheatley) i željezo hematoksilin bojenje. Ove boje se koriste za otkrivanje crijevnih protozoa.

Dye Gomory - Whitley se koristi za otkrivanje mikrosporidije. On ne može otkriti crijevna glista jaja, a ne lichinki- pouzdano identificirati Cryptosporidium. Gljiva i ljudske ćelije su također obojena.

Iron hematoksilin mrlje diferencirane ćelije, aktiviraju stanice i jezgre. crijevna glista jaja mogu biti obojen u tamne boje, što ga čini teško utvrditi.

kultura

Test kulture - rast mikroba na čvrstom ili tečnom povećanje nutrijenata sredinom broja organizama olakšava identifikaciju. Kulture i olakšava testiranje antibiotika osjetljivosti.

Video: Dijagnoza cistitisa. Dio 3 052-2506596

Komunikacija sa laboratorijskim je važno. Iako je većina uzorka materijala stavlja na opće namjene, srednje (npr krvi ili čokolada agar), neke patogene zahtijevaju uključivanje određenih hranjivih tvari i inhibitora ili druge posebne usloviy- ako je jedan od tih patogena se sumnja ili ako pacijent dobio antibiotike, potrebno je prijavi u laboratoriju. O izvoru izvještaja uzorka takvih podataka u laboratoriju mogu razlikovati patogena od normalne flore.

Uzorkovanje je važno. Pogrešan tip bris može dovesti do lažno negativnih rezultata. Drveni štapići za šipke razmazati otrovan za neke viruse. Štapići s vatom vrh otrovan za neke bakterije i klamidiju. Krv kulture zahtijevaju dekontaminaciju i dezinfekciju kože (npr povidon jod brisevi bilo dopušteno da se osuši i je uklonjen sa 70% alkohola). Obično se koriste više uzoraka, svaki iz posebne ograde mesta- poželjno vrši na vrhuncu groznice, ako je to moguće. Normalnu floru kože i sluzokože, koja raste čak u istom uzorku krvi, tretiraju kao inficirane. Ako se uzorak krvi dobijen od centralne vene ili arterije, periferne uzorak krvi treba uzeti da pomogne razlikovati sistemski bakteremija od katetera infekcije. Kultura zaraženih katetera obično postaju pozitivni brže i sadrži više organizama u odnosu na oba u kombinaciji kulture periferne krvi. Neki gljive, posebno tla (npr Aspergillus sp.), Obično ne može biti uzgojeno iz uzoraka krvi.

Uzorak treba brzo prevoziti u odgovarajuće srednje i pod uvjetima koji ograničavaju rast bilo koje druge potencijalno zarazi flore. Da precizno utvrdi iznos od patogena treba spriječiti rast patogenih dodatne kopije moraju biti odmah prevezeni u laboratoriju ili, ako se prevoz kasni, datum u frižideru (u većini slučajeva).

Postoje posebni uvjeti za pojedine usjeve.

Anaerobnih bakterija ne treba studirao na testu kulture, kao diferencijacija patogena iz normalnu floru često nemoguće. Uzorci Uzorci treba zaštititi od zraka. anaerobni transport medija se koriste za četkice. Uzorci Uzorci prikupljeni pomoću šprica (na primjer, sadržaj apsces) moraju se prevoziti u špricu.

Mikobakterije je teško njegovati. Uzorci koji sadrže normalnu floru (npr sputum), mora prvo biti deaktiviran i koncentriran. Mycobacterium tuberculosis i neke druge mikobakterija raste sporo. Rast M. tuberculosis, imaju tendenciju da se javljaju brže u tekućinama u odnosu na čvrstoj podlozi. Tipično, upotreba automatskih sistema sa tečnom mediju može se povećati u roku od 2 tjedna u odnosu na >4 nedelje na čvrstoj podlozi (agar Lowenstein - Jensen). Osim toga, mali broj organizama može biti prisutan u kopiji. Ograda više instanci na istom mjestu može pomoći povećati vjerojatnost detekciju patogena. Tokom 8 nedelja vakcinisani medij ne treba miješati. Ako se sumnja atipične Mycobacterium, treba obavijestiti laboratoriju.

Virusi obično kulturom na razmazima i uzorke tkiva, obično prevozi u sredinama koje sadrže antibakterijska i antifungalna sredstva. Sadržaj uzoraka inokulisane uzoraka u kulturi tkiva, koje podržavaju rast virusa i spriječiti sve ostale mikrobe. Virusi su vrlo nestabilne (npr zoster virus) su inokulisane u kulturi tkiva u roku od 1 sat naplate. Standard kulture tkiva je najosjetljivije. kulture Express tkiva ćelija (plaka metoda: brojanje mrlje na monolayer zrnaca) može pružiti brže, ali ukazuje na rezultate. Neki uobičajeni virusi ne mogu biti otkrivene pomoću konvencionalnih metoda kulture tkaney- zahtijevaju alternativne metode dijagnoze.

Uzorci gljivice izvedeni iz ne-sterilne stranicama treba vakcinisati u mediju koji antibiotik. Slučajevima moraju čuvati za 4 tjedna prije bacanja.

test osjetljivosti

Analize osjetljivosti odrediti mikrob otpornost na antibiotike izlaganjem standardiziranog koncentracija antibakterijskih lijekova. Analiza osjetljivosti može se vršiti za bakterije, gljivice i viruse. Za neke organizme, rezultati dobijeni od jedne droge za predviđanje rezultata takvih droga. Dakle, nisu svi potencijalno aktivne droge su testirani.

Test osjetljivosti se provodi in vitro i ne može uzeti u obzir mnogo faktora prirodnih uvjeta (npr farmakokinetike i farmakodinamike, funkcija koncentracije droge u pojedinim tkivima i organima tijela ljudskog imunog sistema), koji utiču na uspjeh liječenja. Prema tome, rezultati testa na osjetljivost ne uvijek predvidjeti ishod liječenja.

Test osjetljivosti može biti kvalitativna, semikvantitativnog ili metodama za izolovanje nukleinskih kiselina. Analiza također može procijeniti učinak u kombinaciji primjene različitih antibakterijskih lijekova (test zajednički efekti).

kvalitativne metode. Kvalitativne metode su manje precizne od semikvantitativnog. Prema rezultatima normalno fiksne osjetljivost (S), srednji rezultat (I) ili otpor (R). Najčešće korištena metoda disk difuzije (također poznat kao test Kirby - Bauer) pogodan za brzo rastuće organizme.

Antibiotik impregnirane diskovi su bili smješteni u agar pločama na kojima je testiran mikroorganizam. Sljedeći inkubacije (obično 16-18 sati) se mjeri promjer zona inhibicije oko svaki disk. Svaku kombinaciju antibiotika mikroorganizama imaju različite promjere koji imaju vrijednost S, I, ili R.

Druge metode koje zahtijevaju manje strogo pridržavanje test parametri mogu se koristiti za brzo provjeriti pojedinačne organizam otporan na određeni lijek ili klasu lijekova ili određenih antibakterijska kombinacija (npr, otpornost na oksacilin u meticilin-rezistentni Staphylococcus aureus, proizvodnja B-laktamaze).

Polu-kvantitativne metode. Semikvantitativnog metoda određivanja minimalne koncentracije lijeka koji inhibira rast određenog organizma in vitro. Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) je fiksirana kao broj, koji se onda može smatrati kao jedan od tri grupe: S (osjetljiv), I (srednji) ili (otporan) R. MIC Određivanje se prvenstveno koristi za bakterije, uključujući anaerobe i Mycobacterium se ponekad koristi za gljive, posebno vrsta Candida, izveden iz sterilne stranicama. Minimalna neutralizira (baktericidna) koncentracija (MBC) može se utvrditi, ali je tehnički teško, i standarde za tumačenje još nisu dogovoreni. MBC analiza vrijednost, to pokazuje da li je lijek može biti bakteriostatski ili baktericidno.

Antibiotik se može rastvoriti u agar ili čorba, koji se potom dodaje na mikroorganizam. Lightening čorba - zlatni standard, ali to je dugotrajan jer je samo jedan koncentracija lijeka može se testirati u jednom cijevi. Efikasniji način koristi traka od poliestera film strip impregniran sa odgovarajuće antibiotske koncentracije. Traka je stavljen na tablici s umetanje materijala agar, i IPC određuje lokaciju na traku koja počinje ingibitsiya- veliki broj antibiotika može se provjeriti na istoj ploči.

IPC omogućava korelacija između osjetljivosti mikroorganizma na lijek i koncentracije lijeka dostižan u tkanine, non-protein (besplatno droga). Ako se koncentracija slobodnog droga u tkivu je veća od MIC, vjerovatnoća uspješnog liječenja je visoka. Slično tome, podaci o S, I i R su u korelaciji s BMD. Obično se zasniva na ostvarive koncentracije slobodnog droge u serumu ili plazmi.

Metode za detekciju nukleinskih kiselina. Ovi testovi se temelje na metodama detekcije nukleinskih kiselina slične onima koje se koriste za identifikaciju mikroorganizam, ali modifikovan za otkrivanje poznatih gena otpornosti ili mutacije. Primjer - Meca, gen za otpornost na oksacilin u S. aureus- ako je prisutan gen, organizam se smatra otporna na sve-laktamske antibiotike. Iako je poznato mnogo takvih gena, ali njihova identifikacija nema pravo na definitivan zaključak o otporu in vivo. Osim toga, s obzirom da oni mogu predstavljati nove mutacije ili drugih gena otpornosti, njihovo odsustvo ne garantuje osjetljivost na lijek. Iz tih razloga, kao i zbog toga što su testovi su ograničeni u broju i da su skupi, oni nisu u širokoj upotrebi. Metode za detekciju nukleinskih kiselina ne zamjenjuje standardni test kulturi i uobičajene analize osjetljivosti.

Imunološki testovi za zarazne bolesti

Imunološki testovi koriste antigen za otkrivanje antitijela na patogena ili antitijela za detekciju patogena antigena u uzorku pacijenta. Tretman varira, ali ako vam treba odgoditi analize, uzorak, po pravilu, treba staviti u frižider ili zamrzavanje, za sprečavanje razmnožavanja bakterija.

test aglutinacije. U aglutinacije testovi (npr lateks aglutinacije, koaggregatsiya) čestica (lateks perla ili bakterija) je spojen na antigen ili antitijela reagensa. Rezultirajući kompleks čestice se miješa sa uzorkom (npr CSF, serum) - ako želite antitijelo ili antigen prisutan u uzorku, i umrežavanja čestica se javlja u obliku aglutinacije, koji se može mjeriti.

Ako su rezultati pozitivni, ispitivane biološki sekvencijalno tekućine razrijediti i testirani. Aglutinacije s više razrijeđen rješenja ukazuje na veće koncentracije željenog antigena ili antitijela. Titar pravilno snimiti i recipročne aglutinacije kada razrijeđen u raspadu primjer 32 ukazuje na to da aglutinacije održan u otopini razblaženi u 1/32 početne koncentracije.

Video: Laferobion

Test aglutinacije obično brže, ali manje osjetljivi od mnogih drugih metoda. Oni također mogu odrediti serotipova određenih bakterija.

dopuna fiksacija. Ovaj test mjeri potrošnju dopuna (dopuna fiksacija) antitijela u serumu ili CSF. Test se koristi za dijagnozu određenih virusnih i gljivičnih infekcija, posebno coccidioidomycosis. Uzorak se inkubira sa poznatim količinama komplementa i antigena. Stepen vezivanja komplemenata ukazuje na relativnom iznosu od antitijela u uzorku. Testa može mjeriti antitijela titar IgG i IgM, ili se može modifikovati za detekciju specifičnih antigena. Analiza precizne, ali ima ograničenu primjenu, je dugotrajan i zahtijeva brojne kontrole sredstvima.

povezani imunološkom testu. Ovi testovi koriste antitijela u kombinaciji sa enzimima za otkrivanje antigena ili otkriti i kvantificirati antitijela. Linked imunološkom testu (ELISA) i enzim imunoanaliza, enzim-linked-linked imunološkom (ELISA) se najčešće koriste. Budući da je većina osjetljivih imunoanaliza visoki, oni se najčešće koristi za skrining. Titar može odrediti serijski razrjeđivanje uzorka, kao u aglutinacije test.

Analiza osjetljivosti iako obično visoki i mogu se razlikovati ovisno o dobi pacijenta, serotip mikroba, kao što je uzorak ili klinički stadij bolesti.

Analiza padavina. Ovi testovi mjeriti antigen ili antitijela u telesne tečnosti stepen vidljive taloženja kompleksa antigen-antitijelo u gel (agarozni) ili rješenje. Postoje mnoge vrste analiza na padavina (npr po Ouchterlony dvostruko difuzija, kontra-imunoelektroforezom), ali je njihova upotreba ograničena. Tipično, uzorak krvi se miješa sa test antigen za otkrivanje antitijela zaštitne, često sa gljivične infekcije ili piogenih meningitis. Kao pozitivan rezultat zahtijeva veliku količinu antitijela ili antigen, osjetljivost je niska.

Western blot analiza. Ova analiza pokazuje antibakterijska antitijela u uzorku materijala uzima od pacijenta (npr seruma, drugo tijelo tekućine) od strane njihovih reakcija sa antigena (npr virusne komponente) koje su imobilisani na membranu mrlja.

U zapadnoj blot analiza, po pravilu, dobra osjetljivost, iako je često manja od skrining testova, kao što su ELISA, ali generalno ima visoku specifičnost. To se obično koristi za potvrdu pozitivnih rezultata dobijenih u screening test.

Tehničke izmjene linearan Western blot imunoanaliza (LIA) - analiza rekombinantne imunoblot (RIBA), koji koristi sintetički ili rekombinacije-binant proizvedenih antigeny- i immunochromatographic test koji može brzo testirati uzorke za pojedine mikrobiološke antigena ili antitijela pacijenta.

Metode za identifikaciju ne-nukleinske kiseline za otkrivanje zaraznih bolesti

Čim je identificiran test organizam kulture, to treba utvrditi. non-nukleinske metoda otkrivanja kiselina zaposliti fenotipske (funkcionalna ili morfološke) ima mikroorganizama, a ne genetske identifikacije.

Karakteristike rasta patogena u hranjivoj podlozi - veličina kolonije, boja i oblika, daju informacije za identificiranje vrste, a uz bojenje po Gramu i algoritam za daljnje analize. Na raspolaganju brojne biokemijske testy- svaki karakterističan za određenu vrstu mikroorganizama (npr aerobne ili anaerobne bakterije). Neki procjenjuju sposobnost organizma da koristi različite podloge za rast. Druge procjene prisustvo ili aktivnost ključnih enzima (npr koagulaza, katalaze). Analize se rade, korak po korak. test sekvenca je vrlo raznolik i može se malo razlikovati u različitim laboratorijima.

Non-nukleinske metoda otkrivanja kiselina može biti zasnovana na Priručnik o automatskih sistema, ili to može biti hromatografske metoda. Neki komercijalno dostupni paketi uključuju odvojene testova koje se mogu obavljati dok koristite jedan uzorak materijala i generalno je korisno za postavljanje dijagnoze širok spektar mikroorganizama. Takvi test sistemi mogu biti vrlo precizan, ali može potrajati neko vrijeme, do nekoliko dana.

kromatografske metode. Mikroba komponente ili proizvoda su odvojeni i identificirana pomoću tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) ili plinskom kromatografijom. Tipično, otkrivanje je upoređivanjem masne kiseline organizma u bazu podataka. Hromatografske metode mogu se koristiti za identifikaciju aerobne i anaerobne bakterije, mikobakterije i gljivica. Preciznost ovisi o uzorku kvalitetnu analizu testa kulturu i kvalitetu baze podataka, koji mogu biti netačne ili nepotpune.

Metode za identifikaciju zarazna bolest na osnovu detekciju nukleinskih kiselina

o identifikaciji nukleinskih kiselina na bazi pokazuju određenih metoda za organizam DNK ili RNK vadi iz mikroorganizam. Sekvence mogu biti pojačan in vitro. na otkrivanje tehnike nukleinskih kiselina na bazi su obično vrlo osjetljiv i specifičan i može se koristiti za sve vrste bakterija. Rezultati se mogu brzo dobiti. Jer svaka analiza je obično specifičan za određeni organizam, kliničar treba znati dijagnostičke mogućnosti i tražiti odgovarajuću analizu. Na primjer, ako pacijent ima simptome gripe, ali sezona gripe je završena, drži ukupno virusnih dijagnostički test (npr virusne kulture), a ne određenu analizu gripa je bolje, jer drugi virus (npr parainfluence, adenovirusi) može biti izazvati.

o utvrđivanju nukleinskih kiselina na bazi su kvalitativne testove, ali kvantitativnih metoda određivanja postoje za ograničeno, ali povećava broj infekcija (npr, HIV, citomegalovirus, Human T-limfotropni virus). Ove metode mogu biti korisni za dijagnozu i praćenje odgovora na terapiju.

Metode koje ne uključuju pojačanje nukleinskih kiselina se koristi u slučajevima kada je organizam prvi put otkriven u testu kulturi i prisutna je u uzorku na visoku koncentraciju.

pojačanje. U metode nukleinskih kiselina pojačanja uzima mala količina DNK ili RNK, reproducirati ih mnogo puta, i na taj način može otkriti male tragove mikroorganizama u uzorku. Ove metode su posebno korisni za agente, koje je teško njegovati ili identifikovani koristeći druge metode (npr virusi su obligatni intracelularni patogeni, gljivice, mikobakterije, neke druge bakterije), ili za one organizme koji su prisutni u malim količinama.

Ovi testovi mogu uključivati ​​meta pojačanje (npr PCR, reverzne transkriptaze PCR [RT-PCR], pristranosti sklop pojačanje, pojačavanja transkripcije) pojačanje signala (npr analiza razgranata DNK hibrid snimanje), pojačanje uzorka (npr lančana reakcija ligaze uvodi oblik dekoltea ciklične test) ili postamplifikatsii analize (npr sekvenciranje analiza pojačani proizvod, microarray analize i liquidus kriva, kao što se radi u realnom vremenu PCR).

Odgovarajuće uzorkovanje i skladištenje prije dolaska u molekularne dijagnostičke laboratorije je važno. Budući da je metoda pojačavanja tako osjetljive, lako se lažno pozitivnih rezultata iz trag kontaminacije uzorka ili oprema može biti instaliran. Uprkos visoka osjetljivost, ponekad postoje lažno negativnih rezultata, čak i kada pacijent ima klinički simptomi (na primjer, virusne infekcije zapadnog Nila). Lažno negativni rezultati mogu svesti na minimum

• izbjegavanjem upotrebe štapića za briseva sa drvenim šipkama i vrhove vune
• brzog transport uzoraka,
• zamrzavanje ili stavljanjem uzoraka u frižideru, ako prijevoz traje >2 sata.

Zamrzavanje - tipičan način skladištenja nukleinske kiseline pojačanje testova. Međutim, uzorci moraju se čuvati u hladnjaku, a ne biti predmet zamrzavanje ako sumnja nestabilan virusa (npr herpes zoster virus, virus gripe, HIV-2) ili ako planirate da studirate virusne kulture (smrznute uzorci nisu pogodne za standardne usjeve).