Non-izotopa metode imunoanaliza hormona

Ovo je bila prva metoda za precizno kvantitativno određivanje hormona, je naširoko koristi i odigrao veliku ulogu u laboratorijske dijagnostike poremećaja endokrinog. Ona se zasniva na modernim principima formirana RIA imunoanaliza hormona. Međutim, u proteklih dvadeset godina, RIA je gotovo u potpunosti ispao iz kliničkoj praksi ne-izotopa metode imunoanaliza - ELISA i analiza immunohemilyuminestsentnym. Osnovu tih metoda, kao i u RIA zasnovane na interakciji antigena i antitijela, ali se koristi kao oznaka ne-radioaktivnih izotopa, i enzima koji katalizira reakciju da se formira u boji proizvod, ili svjetlećim supstanca. U prvom slučaju, u završnoj fazi analize optičke gustine reakcije smjesa u drugom - broj fotona emituje svjetlećim supstanca.

Video: Regionalna laboratorijske i dijagnostički centar imunohemijska metode istraživanja IHMI

povezani imunološkom testu

Za kvantitativno određivanje hormona najčešće koriste čvrste faze ELISA sa dva antitijela. Izvodi se u multi-dobro ploča. Na dnu bunara sorbed monoklonskih antitijela specifična za određeni antigeni determinanta hormona. Bunara su uzorci seruma sa nepoznatim koncentracijama hormona ili standardnih uzoraka s poznatim koncentracijama hormona. Ploče je inkubiran 30-120 min-ovom trenutku, hormon molekule uspio povezati sa antitijela apsorbuju na plastici. Nakon inkubacije, bunari su isprane sa puferom za uklanjanje nevezane hormona i ostale komponente u serumu. Zatim bunara što poliklonska antitijela na hormon konjugovane na peroksidazu (tzv konjugata), a ploča je inkubirana za 15-30 min. Pri čemu konjugata molekula vezuje za hormon molekule. Bunara su ponovno oprati ukloniti nevezanih konjugata i povećavaju rješenje sadrži bezbojan peroksidaze podloge. Peroksidaza pretvara podlogu u boji proizvod. Intenzitet bojenja rješenja u bunarima (što je mjereno u fotometar) je direktno proporcionalan iznos konjugata u dobro, a to je - koncentracija hormona. koncentracija hormona u uzorcima seruma se izračunava iz krivulje kalibracije pripremljen od mjerenja koncentracije hormona standardnih uzoraka.

Treba naglasiti da je ovaj ELISA metodom, za razliku od gore opisanih metoda RIA, je nekonkurentna. Činjenica da se u reakciji mješavina odsutni označen antigena i nivo vezivanja poliklonskih antitijela (konjugirana) sa antigen apsorbuju na monoklonska antitijela zavisi od koncentracije antigena u uzorku. Nekonkurentna metode se koriste i kada immunohemilyuminestsentnom analize.

Immunohemilyuminestsentny analiza

Postoje mnoge opcije immunohemilyuminestsentnogo analize. Mi ćemo opisati uzoran utjelovljenje, koji se koristi za mjerenje razine gonadotropina u modernoj autoanalyzer. U ovoj izvedbi, hormon se koristi za vezivanje paramagnetičan mikročestica obložen monoklonskih antitijela vrlo specifična za određeni hormon. Na mikročestice su suspendovani u tampon rješenje i dodao da je suspenzija uzoraka seruma ili standardnih uzoraka. Nakon kratke inkubacije (10- 20 min) mikročestica s vezanim hormon je ubrzao u magnetskom polju i oprati nekoliko puta. Onda se mikročestice resuspendovani u puferu i dodati suspenziju poliklonska antitijela na hormon konjugovane za alkalne fosfataze. Nakon pranja nevezanog konjugata je dodan u suspenziju mikročestica dioksetina fosfat. Pod djelovanjem alkalne fosfataze fosfata dioksetina formirana dioksetin emitting luminiscencija zrake. Intenzitet luminiscencije, koja se mjeri po fotomultiplikatorska, direktno je proporcionalna koncentraciji hormona u uzorku.

Video: Laboratorijska istraživanja

Metode za detekciju autoantitijela

Reproduktivnih poremećaja mogu direktno ili indirektno uzrokovana autoimunim patologija. Na primjer, muške neplodnosti može biti uzrokovana autoimuna reakcija protiv sperme, a u patogenezi neplodnosti kod žena može igrati ulogu autoimuna bolest štitne ili nadbubrežne žlijezde. Markera autoimunih patologija su autoantitijela. Za detekciju seruma autoantitijela (npr antifosfolipidnim antitijela, antitijela na yodidperoksidaze ili 21-hidroksilaze) koriste ELISA metodom immunohemilyuminestsentny analize i indirektne imunofluorescencije. U ovom drugom slučaju, kao antigene podlogu pomoću sekcije kriostat tkiva, protiv koje autoimune reakcije je usmjerena. Za detekciju sperme antitijela u spermi i cervikalne sluzi metoda microagglutination koristiti lateks čestica obložena antitijela IgA ili IgG.

druge metode

Za neke hormone, kao što su kateholamina i serotonin, nije lako utvrditi pouzdane metode imunoanaliza. Činjenica da se ovi materijali imaju vrlo niske molekularne težine i protiv njih je teško doći do vrlo specifičnih primarnih antitijela, monoklonska čak. Slične poteškoće u razvoju metoda za imunohemijska testa steroidnih hormona i njihovi derivati ​​(zbog visokog vjerojatnost cross-reakcije s različitim primarnim antitijelima steroide koji je imao veliku antigeni sličnost). Stoga, za precizno kvantitativna analiza takvih agenata u posljednjih nekoliko godina sve više zaposlenih visoke performanse tečne hromatografije zatim masene spektrometrije.

Često, endokrini poremećaji, uključujući i reproduktivni poremećaji, ne izazivaju patološke promene u nivou gonadotropina i spolnih hormona i njihovi receptori mutacije. Za procjenu funkcija receptora ranije koristila biološkim ispitivanjima in vitro: pacijent je biopsija tkiva koja je cilj hormona, biopsije su bili smješteni u kulturi srednje je dodan u srednjem i evaluirati odgovor na ovaj hormon hormona tkiva. Danas receptora mutacije otkrivene određivanjem sekvence DNK nukleotida u odgovarajućim genima. DNK za takve testove obično pripremljeni od limfocita pacijenta.