Transgenih životinja: tehnologija

Video: Bioseminars.ru: Egor Malashichev - transgenični životinja i komparativne embriologija

Za razliku od biljaka, gdje postoji mogućnost dobivanja plodnog biljka iz transformiše somatskih ćelija i kloniranja, proizvodnja transgenih životinja - vrlo težak i dugotrajan proces.

Strategija koristi je kako slijedi:
1. klonirani gen je uveden u oplođena jajna ćelija jezgru.
2. oplođena jajna ćelija sa egzogeni DNK implantiraju u ženski primalac (jer je uspješan završetak sisara embrion u drugim okolnostima nemoguće).
3. Bleed potomstvo razvio iz implantira jaja koja sadrže klonirane gena u svim ćelijama.
4. skew životinje koje nose klonirana gena u ćelijama klice linije i dati nove genetske linije.

Eksperimenti na genetski modifikovane višećelijskih organizama uvođenjem transgena u njih zahtijevaju mnogo vremena. Međutim, transgenih postati moćno sredstvo za proučavanje molekularne osnove sisara ekspresije gena i razvoj, da se stvori model sistema, što omogućava proučavanje ljudskih bolesti, kao i genetsku modifikaciju mliječne žlijezde životinja ćelija za proizvodnju proteina mlijeka važna za medicinu. Bilo je čak i roman pojam "pharming» (pharming), pozivajući se na proces pripreme mlijeka transgenih životinja autentične ljudske proteine ili farmaceutski proizvodi.

Korištenje mlijeka je svrsishodno jer se formira u tijelu životinje u velikom broju i da nadaivat po potrebi bez štete za životinje. Proizvodi mliječne žlijezde i izlučuje u mlijeko nije roman proteina mora na taj način vrše bez negativnih efekata na normalne fiziološke procese u transgenih životinja, i podvrgnuti posttranslaciona promjena koja, barem blizu onima u ljudskim ćelijama. Osim toga, njegova izolacija od mlijeka, koja sadrži druge proteine, ne smije biti previše teško.

Unatoč činjenici da je prvi transgenih životinja dobijeni su 1985. uvođenje egzogenih DNK u pronuclear zigote još nije razvila efikasna metoda koja bi se mogla koristiti za stvaranje genetski modifikovane životinje, bez obzira na vrstu i svrhu eksperimenta. Razvoj novih efikasnih metoda prijenosa gena u embrionalne i somatskih ćelija životinja, kao i poboljšanje postojećih pristupa hitna zadatak.

Među velikim različite načine uvođenja egzogenih DNK u životinju genoma mogu se izdvojiti, koji su naširoko koristi u praksi transgenih:
- metoda mikroinekcija,
- retrovirus-posredovana transfer gena,
- modifitsirovanngh korištenje embrionalnih matičnih stanica,
- transfer transformisao jezgara generativnog i somatskih ćelija
- korištenje spermatozoida i spermatogonija kao vektori DNK.

Među druge metode pružanja egzogene DNA u organizam životinja može napomenuti upotrebu liposoma, adenovirus vektori, kao i način ubrizgavanje velike brzine. Međutim, ove metode nisu u širokoj upotrebi zbog nedovoljne stabilnosti i nedostatak integracije transgene u genom.

Mikroinekcija rekombinantne DNK u oplođenih jajnih ćelija višećelijskih životinje su i dalje najpopularniji način da se uvede stranih gena u životinje. Unatoč činjenici da je ova metoda zahtijeva visok vještina i skupe opreme, jednostavnost i pouzdanost plaćaju sve svoje nedostatke.

Prva i uhodani eksperimentalni sistem za proizvodnju transgenih životinja je miš. Donator ženki miševa s eksperimentalnim superovulacija uparen sa muškarcima za proizvodnju, nakon 12 sati bila izolovana oplođena jaja i staviti u kulturi. Nadalje, veći od dva pronuclei (obično muški) je ubrizgan rekombinantni DNK (sl. 2.17). Preživjelih ubrizgava jaje je transplantiran u ženski primaoca. Samo dio transplantiranog oocita nastavila da se razvija do teljenja.

Sl. 2.17. Mikroinekcija egzogeni DNK u pronucleus oplođene sisara ova pod mikroskopom (a) i eksperimentalne podešavanje (B)

Učestalost integracije egzogenih DNA metodom mikroinekcija je pod uticajem faktora kao što su čistoća ubrizgavanje uzorka, oblik i koncentracije DNA, sastav pufera za mikroinekcija, kvalitet embriona, kao i način embriotransfera primaoca (nehirurãku, hirurški, laparoskopska).

Transgenih životinje su identificirani u potomstvu razne metode, većina PCR i uparen da dobiju transgenih linija. Neki od transgenih životinja su mozaik (klica ćelija ne sadrže egzogene DNA) ukrštanjem transgenih stoga je manji dio prve generacije potomaka od izračunate 50%. U nekim slučajevima, homozigot linije ne može dobiti zbog transgenih umetanja 5-15% homozigotnom smrtonosan, kao umetanje ponekad krši vitalnih dijelova genoma.

Tačan mehanizam za integraciju ubrizganog DNK u hromozoma ciljne ćelije se ne zna, ali analiza umetnute DNA struktura otkriva neke stvari. Integracija javlja slučajno na jednom kromosomskih lokusa, koji može sadržavati jedan do nekoliko hiljada tandem kopija integriranog DNK. Oko 30% primarne transgenskih životinja dobila obično pokazuju određeni stupanj mozaika koji mogu nastati iz integracije egzogeni replikacije DNK nakon prvog ciklusa.

Stepen integracije egzogenih DNK u genom, i.e., broj transgenih životinja od ukupnog broja rođene životinje koristeći metodu mikroinjekcija, u zavisnosti od vrste varira u malom rasponu od 5-15%. Najvažniji s obzirom na troškove potrebne za proizvodnju jednog transgenih životinja transgenih ukupni indeks efikasnosti, koja se izračunava kao odnos dobijenih transgenih životinja od ukupnog broja presađenih embriona, izražen kao postotak. Vrijednost ovog indeksa za sisavce je relativno konstantna i iznosi u prosjeku ~ 0,5% za svinje i krave na oko 2% u miševa.

Antiretroviralne vektora se koriste za stvaranje transgenskih životinja. Infekcija prijemplantacionog embriona rekombinantne retrovirusi - relativno jednostavan efikasan postupak.

Vosmikletochnuyu Morula (sl. 2.18) pušten iz ljuske jajeta i stavljen u kulturi jelo sa fibroblasta proizvodnju rekombinantnog retrovirus. Zaražene embriona dostigla fazu blastule su implantirani u pseudopregnant žena. Kao rezultat toga, transgenih organizama generiraju, mozaici prema broju i lokaciji uzidani rekombinantne DNA u genom. Zbog toga, da dobije čistih linija dalje zahtijeva velike outbreeding.

Nedostatak ove metode je da se ograniči umetanje egzogenih DNA ~ 8 robe široke potrošnje, pri čemu transgene može biti lišen susjednih regulatorne sekvence neophodne za njegov izraz, au nekim slučajevima, integrirati u originalnu lokusa nestabilan.

Novi lentiviral vektori (lentiviruses pripadaju porodici retrovirusa) su pokazali da su vrlo visoku efikasnost u pružanju DNK u oocita i zigote. Ubrizgavanje rekombinantnog lentiviral konstrukata u perivitelline prostor svinja zigote i goveda oocita rezultiralo pojavom potomstva sa najvećim trenutno režnjeve transgenih životinja. U isto vrijeme, lentiviral vektori imaju sve nedostatke antiretroviralne: mala veličina umetanje egzogenih DNK i više integracije u genom domaćina, što može dovesti do neželjenih efekata kao što su aktiviranje onkogena i insercione mutageneze. Osim toga, lentiviral vektori za visok stepen mozaika transgenih potomaka proizvode i pojedinačne činjenice utišavanje (inaktivacije) rekombinantni lentiviral sekvence dobiti transgenih linija.

Korištenje retrovirusa vektora ima jednu veliku manu. Iako su ovi vektori su stvoreni tako da su replikacije defektne retrovirus soj genom (pomagač virus) koji je potrebno pribaviti velike količine vektora DNK može pasti u istu jezgru kao transgene. Uprkos svim poduzetim mjerama, retrovirusi pomagači mogu replicirati u transgenih životinja, što je apsolutno neprihvatljivo, ako ove životinje koje će se koristiti kao hrana ili kao sredstvo da dobije komercijalni proizvod. I jer postoje alternativne metode transgeneza, antiretroviralne vektori se rijetko koriste za proizvodnju transgenih životinja koje imaju komercijalnu vrijednost.

Sl. 2.18. Sheme za dobijanje linije transgenih miševa pomoću antiretroviralne vektora

Modifikovana embrionalne matične ćelije mogu se koristiti za dobijanje transgenskih životinja. Ćelije izoliran od mišje embrija u fazi blastociste, mogu razmnožavati u kulturi, zadržavajući mogućnost da se diferenciraju u bilo tipova ćelija, uključujući i klica linija ćelije, kada se daje u drugoj embrija do faze blastociste (sl. 2.19).

Takve ćelije nazivaju se pluripotentne embrionalnih matičnih stanica (ES). ES-ćelija u kulturi mogu uvesti transgene ciljne različite tehnike (transfekcije, elektroporacija, retrovirusnih infekcija, itd) bez ometanja njihove pluripotency. Praktična prednost ovog programa je da daje veliku šansu za izbor ćelije za određeni parametar. To može biti broj kopija transgene, njegove lokalizacije ili izraz obrasce.

Znajući slijed okolne određenu lokaciju za željeni integracije, možete konstruirati vektor za ubacivanje ciljne DNK homologna rekombinacija. Na primjer, zamijenite gen kodira lako prepoznatljive indikacija za svrhu selekcije uklanjanjem njegove ili vraćanje funkcija u rezultat transgenih ćelije.

Na isti način, tzv nokaut miševa (knock out) - miševi s inaktiviranim usmereno specifične celularne gen za proučavanje svoju funkciju. Da se izvrši homologna rekombinacija vektor je napravljen od fragmenata ciljnih gena, koja je zakazana za inaktiviraju dio ciljnog gena se zatim zamijenjen je izabrati marker za odabir ćelija sa integrisanim dizajna.

Sl. 2.19. Priprema transgenih miševa rekonstrukcijom embrion koristeći genetski modificirane embrionalnih matičnih stanica (ES-ćelija). ES-ćelije su izvedeni iz unutarnje ćelije mase blastocista miša

Izabrane transgenih ES-ćelije mogu biti uzgojeno i koristi za proizvodnju transgenih životinja. Ovo sprečava slučajno ubacivanje transgene, što je karakteristično za metodu i Mikroinekcija retrovirusa vektor sistema.

Sve primljene u okviru ovog programa mozaici životinje su toliko neophodne uzgoj rad dobiti čistih linija. Primarni problem mozaik transgenskih životinja može prevazići presađivanjem jezgra transformiran ES-ćelija u enucleated oocita koje su potom nastavili su normalan razvoj. Kao rezultat toga, u svakoj ćeliji životinje dobiti će sadržati transgene.

Nažalost, pluripotentne ES-ćelija, slično miša dok ne nalaze u drugim sisara i ptica, ali potraga se nastavlja.

Nuklearni transfer transformiše generativnog i somatskih ćelija u jaje, ili somatske nuklearni transfer (somatske transfer nuklearne), još jedan metod koji se koristi u praksi transgeneza. Pokazano je da je jezgra embrionalnih ćelija raznih životinja kada prebaciti na enucleated jaje ponekad u stanju da osigura razvoj novog organizma. Nakon kratkog uzgoj čak i srž nekih od diferencirane ćelije su u stanju da osigura razvoj održivog pojedinca.

Na primjer, poznati ovce Dolly je klonirana 1997. spajanja kulturan (3-6 prolazima) dojke epitelnih stanica (vime) odrasla životinja sa šest godina lišen jajašce nukleus (sl. 2.20). Iako ne možemo isključiti mogućnost da je kloniranje slučajno uzeti nediferencirane stanice prisutne u donatora epitel.

Sl. 2.20. Kloniranje ovce nuklearnog transfera. Dojke epitelnih stanica u kulturi je inducirana da uđe u fazu G0 (pozornicu na kojoj je jaje). Zatim, fuziju takve ćelije sa enucleated oocita i embrija se uzgaja u ranoj fazi embriogeneze. Nakon čega se embrioni se implantiraju u maternicu surogat majke, gdje je daljnji razvoj odvija. U eksperimentu, J. Wilmut (I. Wilmut) kloniranja je izveden Dolly 277 M enucleated ova sa dojke ćelije u fazi G0 od 29 preživelih embriona razvijenih na samo jedan održiv organizam

Dolly Kloniranje diferencirane stanične jezgre, a druga tri ovce iz embrionalnih ćelija jezgre mogao implementirati prenošenjem jezgra iz ćelije koje su u fazi mirovanja (G0), a možda i karakteristike životinja embriogeneze. U ovaca zigote u prva tri divizije, zauzima nekoliko dana, samo da dođe do DNA replikaciju, nijedna od gena nije izražen. Pretpostavlja se da je u to vrijeme uveo DNK je pušten iz ćelija specifičnih regulatornih proteina i odgovarajuće gene povezane sa embrionalnog razvoja embrionalnih faktora inicijator proteina iz citoplazme jajeta.

Dok kloniranje tehnologije su i dalje vrlo daleko od savršenstva - kloniranih Dolly otkriva mnoge znakove preranog starenja, to je vrlo obećavajuće tehnologije za proizvodnju transgenih životinja. Čak i ako postoje razni problemi sa prvom generacijom, najvjerovatnije, druga generacija neće imati nedostatke, stečena kroz upotrebu "starih" za jezgro jajeta.

Glavni problem će biti riješen kako bi se stvorili bilo transgenskih životinja metodom nuklearne transfer bio pravi, - je očuvanje pluripotentne ćelije u kontinuiranom kulturi. Trenutno se aktivno traži faktora reprogramiranje diferencirane ćelije da izazove pluripotency. Ako uspije, genetičke modifikacije ovih ćelija i stvaranje transgenih organizama somatskih nuklearni transfer će postati gotovo rutinski postupak, a dok su izolovani uspješne eksperimente.

Artificial hromozoma kao transgene vektor. Većina transgena su cDNA male geni (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы.

S obzirom na sve to, korištenje čelika za transgenih kvasac umjetni kromosom (YAC), zatvarajući fragmenti genomske dužine DNK od 100 do > 1000 potrošačke robe i umjetnih kromosoma još veći kapacitet (oko umjetnih kromosoma). Ove episomal vektori imaju još jednu prednost - izbjeći efekt položaj ekspresije gena kada se egzogeni DNK. Nivo izraz ubačen gen je veoma zavisna od kromosomskih položaju, na primjer, ugrađivanje neaktivan hromatin (heterohromatina) netaknuta hromozoma dovodi do gena inaktivacije.

Koristeći kvasac umjetni kromosom (YAC), noseći nekoliko povezanih gena ili velike gen, transgenih miševa su generiše mikroinekcija u pronucleus jedne oplođene jajne, ili transfekcije ES-ćelija. Transgenskih miševa nosi klaster ukupne dužine pet funkcionalnih ljudskih globinskog genovv od oko 250 robe široke potrošnje, svi ovi geni su izražene tkiva posebno i u pravo vrijeme na potpuno isti način kao što to čini kod ljudi. Takva skladu je osigurana njihova bočne sekvence koje sadrže promotor i drugih regulatornih elemenata koji su važni. Koristeći YAC-transgenih miševa su dobijeni da sintetiziran samo ljudska antitela tetrameric kompleksne strukture dva para različitih polipeptidnih lanaca.

Ljudskih umjetnih kromosoma (ljudski umjetni kromosom -HAC), koji sadrži čitav ljudski imunoglobulin lokusa s teškim i lakim lancima su uvedeni u goveda fibroblaste, koji se zatim koriste za somatskih nuklearni transfer. Primljeni transkhromosomalnye teladi izraze ljudskih imunoglobulina u krvi. Ovaj sistem je bio važan korak u pravcu proizvodnje životinja terapijskih ljudskih poliklonskih antitijela.

Dalje posmatranje transgenih životinja su pokazala da rekombinantne HACs su održavani u većini prve generacije pojedinaca tokom nekoliko godina. Da li je ili nije primio umjetnih kromosoma na odgovarajući način razdvojiti tokom mejoze i naslijedila, ostaje da se vidi.

U novije vrijeme, nova obećavajuća tehnologija za životinje s genima sa invaliditetom - mali ometa RNA (siRNA, siRNA), koji se koriste za isključivanje ciljem gena (utišavanje). RNA interferencija - konzervativni post-transkripcije regulatornog procesa. Dvolančane mali miješa siRNA u 19-23 nukleotida veže specifično na svoj komplementarni slijed predloška ciljne mRNA, usmjeravanje duž degradacija put.

RNA interferencija je dio regulacije gena sistema, odnosno kontrole / potiskuje prevod mRNA endogenih i egzogenih virusnih elemenata i može se koristiti u terapijske svrhe. Za prolazne gen isključi sintetičkih siRNA su transfektovane u ćelije ili početkom embriona. Za stabilan gen represije siRNA sekvenci treba ugraditi u genom kao dio izraza gena konstrukt.

Vrlo efikasna kombinacija lentiviral vektora sa siRNA za integraciju u genom. Za razliku od klasične knock-out strategija koja zahtijeva dugo uzgojnih linija za dobijanje čiste inaktivirani gen u oba lokusa diploidnih genoma siRNA integracije lako može isključiti meta gen u bilo koje životinje na raspolaganju linije.

Uprkos širok spektar tehnika razvijena za proizvodnju transgenih životinja, do sada nije pouzdan i efikasan tehnologija za transgenih životinje. Najveći problemi su vezani za umetanje slučajnih egzogeni DNK u genom sa većinom postojećih metoda. Tako da dalje kvalitetnu tehnologiju poboljšanja potrebno razviti viđenje modifikaciju ćelijski gena i precizno umetanje egzogenih DNK u genom.

Što više da većina genoma ekonomski važnih organizama do sada potpuno raspoređene i mogu planirati budućnost strukturu transgenih organizma. Kombinacija u potpunosti dekodirane genoma sekvence sa metodama ciljanih isporuke egzogenih DNK će omogućiti izgradnju transgenih ciljanih genoma s unaprijed svojstva.

NA Warriors, TG Volova

Udio u društvenim mrežama:

Povezani