Metode za laboratorijske dijagnostike od Chlamidijama infekcije u maksilarni sinusitis

Video: Otorinolaringolog Ponidelko SN (SM Klinika)

I. Tsitoskopichesky metoda otkrivanja Chlamydia

To je predložio dvije metode koje se mogu podijeliti u invazivne i neinvazivne. SAŽETAK Prva je da je materijal za proučavanje je sadržaj maksilarnog sinusa, što je rezultiralo u punkcije iglu Kulikovskii koji je nakon centrifugiranja je korišten za pripremu razmaza.

Druga metoda je kako slijedi: nakon nosne anemizatsii 0,1% epinefrin rješenje i primjenu anestezije središnjem dijelu nosne prolaz dikaina 3% rastvor - 0,3 ml, pomoću posebnog za jednokratnu upotrebu četke koje ograde materijala tokom rotacionog kretanja između 10-15 medijalne površine srednje nosne školjke i lateralnog zida nosa u području sinusa anastomoze. Tako je dobivena materijal ravnomjerno raspoređena na staklenu pločicu, klima-sušene i fiksni u aceton za 10 minuta na 4-6 ° C. Spremni brisevi mogu biti pohranjeni sve dok se studije za 2 tjedna. na temperaturi od 2-6 ° C.

Slikanje na Romanovsky-Giemsa. Ex tempore boju razrijediti s destiliranom vodom 01:10. Slajdove su postavljeni u Petri jelo drvenim palicama dole droge. Prostor između moždanog udara i na dnu čaše je ispunjen bojom. Bojanje se vrši za 45 minuta. Onda staklo temeljito oprati u tekućoj vodi, osušen sa filter papirom i razliku u zakiseljeno alkohol (100 ml 96% etanola je dodan 10 kapi glacijalne octene kiseline). Nakon bojenja priprema se sagledati u svjetlu mikroskopom pomoću uranjanja u objektiv (X90). U ovom slučaju, citoplazmi ćelije obojena plavo, jezgra - u citoplazmi Uključene klamidije violet-blue određuju kao tamno plave ili roze Mikrokolonije na pozadini plavog citoplazmi. U koraku osnovnoj tijela Chlamydia Uključene su zaprljane roze korak od početnog ćelija u plavoj boji (Ponidelko SN, 2001). Da bi se povećala sadržaj informacije metoda morfološke studije obavlja u brojanjem neutrofila, limfocita i makrofaga u razmazima pripremljenim prije tretmana i dinamiku pod uticajem droga upravlja.

II. Metodom neposredne imunofluorescencije

Razmazima pripremljenim od soskobnyh materijala, kao i krv razmaza obojen s mješavinom uzeti u radnim razrjeđenjima polivalentan imunoglobulin fluorescentne Chlamidijama i goveđi albumin, označen Rodaminom za kontrastne pozadine. Koristite radnom razrjeđenju seruma 1 / 20-1 / 40. Slajdove sa ispitnog materijala i postavljen boja je stavljen u vlažnu komoru u termostat za 30 minuta, nakon čega se staklo se skida i intenzivno oprati u fosfat puferom slanog (pH 7.2) na magnetskoj mješalici za 1 sat, mijenja tampon nakon 30 minuta. Na sušeno brisevi primjenjuje jedna kap puferom glicerola (9 ml glicerola i 1 ml fosfat puferom slanog), a zatim su prekriveni staklom (Ponidelko SN, 2001). Pripreme su trenutno pod fluorescentnim mikroskopom "LUMAM-OUT". Analiza profitabilnosti se vrši vizuelno. Rezultati se smatraju pozitivnim, ako u pripremi otkrivena morfološki tipične klamidiju elemente specifične fluorescentno smaragdno zelene ili žuto-zeleni:

Chlamydia retikularna ćelija (PT) i klamidiju klaster u citoplazmi u obliku Mikrokolonije, koje imaju oblik kompaktnog, difuzno obojena formacije različitih veličina - 0,25-1,5 mikrona;
elementarnih organa klamidija (EBS) - formacija koja su uglavnom izvan ćelije, sferne ili ovalnom obliku koji imaju različite boje, obodnim RIM u obliku zatvorenog prstena ili poluprsten veličine 0,25-0,5 mm;
intercellularly nalazi uključivanje - velike svijetle zelene pjege formirana su blizu jedni drugima ET.

III. serološke metode

volumen krvi u 2.5-3.0 ml u postu subjekata preuzet iz kubitalni vene u suhom centrifuga cijevi. Epruvetu krvi kako bi se bolje ugrušak povlačenje corpuscles inkubiraju na 37 ° C u trajanju od 40-45 min. Nakon inkubacije cijev se centrifugira 20 min na 3000 okr. / Min ugrušak "zaokružiti", a cijev je postavljena za 1 sat u frižideru, a zatim, koristeći Pasteur pipete, serum je odvojen od taloga. Sera prebačeni su u laboratoriju u narednih 1,5-2 sata ili pohranjene na 4-6 ° C za 1-3 dana. Pojedinačnih uzoraka seruma sadrži dozvoljene u zamrzivaču u frižideru na temperaturi od minus 20-40 ° C dok se serijski studije u periodu do 6 mjeseci.

Najspecifičniju i informativan (90%) smatra da je reakcija indirektne imunofluorescencije (RNIF). Otkrivanje antitijela na klamidiju samo jednom uzorku seruma čak i kada je njihov nastup titar 1 / 8-1 / 16 može ukazati na vjerojatnost trenutne kao Chlamidijama infekcije i prisutnost reakcije traga u vezi sa bilo koje bolesti Chlamidijama etiologije migrirali prošle. Povećanje Chlamidijama subtitles antitijela 1 / 64-1 / 256, pa čak i više u jednom uzorku seruma na trenutnoj dug i kompliciran oblika infekcije odražava gomilanje ograničenje mikroorganizama humoralni odgovor i odgovarajuće rezultate kliničkih i epidemioloških analiza i anamnestičkih podataka sticanje dijagnostičke vrijednosti.

Indirektne imunofluorescencije tehnika omogućava identifikaciju Chlamydia da formiraju sa odgovarajućim test objektima i titracije seruma u odnosu na specifične vrste agenata, također omogućava da se ocijeniti sadržaj seruma pojedinačnih klase imunoglobulina u prisustvu komercijalne fluorescentne Ig M, A, G. Negativni rezultati serološke testove ne isključuje prisutnost akutnog ili hroničnog (uporan) Chlamidijama infekcije (Ponidelko SN, 2001).

Koristeći RNIF maksilarni sinusitis kod pacijenata odrediti titar hlamidiju antitijela u serumu. Kao što se koristi antigene pripreme pripremljen na razmaza graniči slajdove mikroba suspenzije, određen za 30 min sa hladnom acetonom. Materijal za razmaz suspenzije su mješavina žumance sac Chick embriona ili organa bijelih miševa inficiranih sa C. trachomatis, C. pneumoniae i C. psittaci.

Ovi antigeni pripreme, ima specifičnost do nivoa roda, treba navesti Chlamydia antitijela (AT) epidemiološki značajno za sve vrste klamidije. Test serum na razrjeđivanje 1: 2 do 1: 256 se primjenjuje na brisevi, stakla, staviti u vlažnu komoru i inkubiraju na 37 ° C u trajanju od 15-20 min. Nakon izlaganja, test materijal se ispere sa vodom iz slavine, a zatim staklo je uronjen u kup baterije fosfat puferom slanog pH 7.2-7.4, a zatim isprati destiliranom vodom. Nakon sušenja na sobnoj temperaturi da će izazvati mrlje uzeti na radnom razrjeđivanje zec anti-ljudskih imunoglobulina svjetlećim i postavljanje stakla u vlažnu komoru, inkubiraju na 37 ° C u trajanju od 15-20 min. Zatim bojanje mješavina je uklonjena, staklo se pere u fosfat puferom fiziološkog pH 7.2-7.4 za 10 minuta, isprati destiliranom vodom i suši na zraku.

Mikroskopija obojenog preparata izvedena sa fluorescentnim mikroskopom. Intenzitet specifične fluorescencije u formulacijama je ocijenjen od strane konvencionalne chetyrehkrestovoy skale (Ponidelko SN, 2001):

"++++" - svijetle fluorescentne smaragdno zelene oko EBS jasno vidljivi svjetlosni "felge";

"+++" - dovoljno pametan fluorescencija žuto-zelene boje, periferne "felge" u ET se može otkriti;

"++" - slab fluorescencija, patogen morfološki otkrio sasvim jasno, ali perifernim "felge" u ET jedva vidljive;

"+" - slab fluorescencija, boja nedefinisan morfologija mikroskopija prigovor vidljive loše.

Za dijagnostički-značajan titar anti-hlamidija antitijela uzeti maksimalno serum razrjeđivanje koji pruža specifične bojenje ne manje od "++". Pri vrednovanju sera serološke aktivnost protiv Chlamidijama antigena za primanje dijagnostički značajan titar 1: 8 i više.

IV. Metoda lančane reakcije polimeraze

Lančane reakcije polimeraze (PCR) je prvi put opisana 1985. godine i postala je standardna metoda DNK pojačanja u mnogim laboratorijama za molekularnu biologiju. Osnova tehnike čine oligonukleotidi usmjerena ponavljaju ciklusa sinteze DNK vode u replikaciju in vitro ciljne sekvence nukleotida. Kao rezultat toga, pojačanja može doći do 1 milijardu kopija ciljne DNK, koji se mogu otkriti ili gel elektroforezom ili hibridizacijom sa specifičnim sonde, zatim detekcija hibrida ELISA testa (ELISA). PCR ima visoku vrsta specifičnost i osjetljivost do 10 molekula DNK (Ponidelko SN, 2001).

Nakon prikupljanja materijala u skladu sa gore procedure pomoću specijalne četke za jednokratnu upotrebu je smještena u sterilnim epruvetama, 2 mL (epindorfy) pripremljen unaprijed u tampon (0,9% -tna otopina natrij klorida). Materijal za 2 sata ili prevezeni u laboratoriju nakon smrzavanja do temperature minus 18 ° C se održava dugo prije studija.

Rezultat analize se smatra pozitivnim ako je:

Veličina DNK proizvod u kliničkom uzorku tačno odgovara DNK proizvod kontrolni uzorak;
u uzorku koji sadrži klinički uzorak i internim standardima, prepoznaje se po specifičnom DNA proizvod unutarnjeg standarda;
u uzorku koji sadrži vodu (negativna kontrola) umjesto kliničkog uzorka, proizvod DNK je otkriven.

Rezultat analize smatra negativnim ako:

u uzorku koji sadrži klinički uzorak, ne može se otkriti specifične DNA proizvoda;
PCR rezultira u oba uzorka kontrolu specifične DNK proizvodi ne otkriva.

Analiza je ponovljena ako:

u uzorku, koji se sastoji od kontrolne DNK, DNK-specifičnih proizvoda ne može biti otkriven;
u uzorku prema internim standardima specifične DNA proizvodi ne mogu biti otkrivene, a otkrivena specifičnim DNA proizvod na negativnu kontrolu.

V. metoda kulture za izolaciju Chlamydia

Izolacijom patogena na kulturama ćelija (HAC), koji je prethodno tretirana sa raznim antimetaboliti, je jedan od najboljih načina za klamidiju dijagnozu, takozvani "zlatni standard".

Materijal se uzima kao direktna metoda imunofluorescencije (PIF) sterilni specijalne četke. Primljeni materijal se nalazi u transportnom mediju. Kao transportni medij je fosfatni pufer s saharoza, kojoj se dodaje prije upotrebe topline inaktiviraju goveđeg seruma na 4% od ukupnog broja, streptomicin 50 .mu.g / ml amfotericin B 25 mg / ml medija. isporuke materijala u laboratoriju se obavlja (u termos sa ledom) najkasnije u roku od 2 sata nakon uzorkovanja. Kulture vrši pomoću staničnoj kulturi LLC + MR2 + L929 + BHK-21C umjetno nizak otpor. Pokupiti materijal je laminirana na monoslojeva mobilnih kultura, uzgajaju na pokrovna, prethodno isušeno srednji rast. Zatim, zaraženi staničnih kultura se nalazi u bočicama i centrifugira za 1 h na 3000 okr. / Min, što povećava broj intracelularne uključaka. Nakon centrifugiranja, materijal se sipa u bočice, dodajte izolacijskog srednje "Needle» (Eaglas MER) sa tsiklogeksamidom u koncentraciji od 2 mg / ml. Cijevi su inkubirane u termostatu na 37 ° C za 48-72 sati (odgovara vremenu ciklusa klamidija), nakon čega su pokrovna uklonjen iz monolayer sa cijevi, postavljen na staklo slajdovima dole monolayer u kanadskim balzamom i utvrđivanje uključivanje patogena. Prije ovog, fiksacija i bojenje vrši mrlje flyuorestsiiruyuschimi antitijela, a rezultati ocijenili nakon 48-72 sata po PIF (koristeći određene poliklonskih i monoklonskih antitijela). Nakon prijema negativnih rezultata proizvode nove seme (prolaz) materijala. Infekcija monolayer ćelije i vrednovanje rezultata vrši se standardnim metodama.

Način dijagnostičke raspodjele klamidije u staničnoj kulturi moraju se koristiti tokom cijelog perioda bolesti, osim za period antibiotske terapije i za 2-3 mjeseca. nakon njega. Za kontrolu lijek kako bi se utvrdile održiva klamidija, koja može ostvariti svoj puni životni ciklus, ova metoda se koristi, nakon 3 mjeseca. nakon završetka liječenja.

VI. elektron metodu mikroskopije

Kako bi se formirala dijagnostičke uporne Chlamidijama infekcije u maksile metoda sinusitis pomoću elektronskog mikroskopa. Studija biopsije materijala nosne sluznice i sinusa. Za tu svrhu, nadražaj sekcije odmah nakon ograde su fiksirane u 2,5% glutaraldehid -ta 0,1 molarna cacodylate puferu pri pH 7,4 za 2-24 sati. Nakon pranja tri puta u cacodylate tampon dofiksiruyutsya 1% rastvor osmiuma tetroxide za 1,5-2 sata. dehidraciju se provodi u alkohole povećanja koncentracije droge za 15-20 minuta, a impregnacija smola kao mješavina sa Epona aralditom. U zaključku, polimerizacija se provodi u inkubatoru za 3 dana. na 37 i 60 ° C Nakon polimerizacije semithin sekcije bili spremni do 1 mikrona debljine na ultratome LKB-3 (Švedska). Stained kriške vrši se po metodi predložio C. D. Humphrey, F. E. Pittman (1974), metilen plavo, azurno-2 i osnovne Fuksin za pregled i analizu pod svjetlosnim mikroskopom (Ponidelko SN, 2001). U isto vrijeme za snimanje fotografija pomoću photomicroscope «Opton» (Njemačka). Zatim pripremiti ultratanki sekcije debljine 3700 angstrema, nalazi se na njihovom bakra veličini oka između 200, zatim u suprotnosti sa zasićenim 30% etanola rješenje i dovesti citrat (Reynolds). Odjeljci su ispitani pod elektronskim mikroskopom «JEM 100S» (Japan) na ubrzanje napon od 80 kV, uz povećanje x5, x10, x30, x50 hiljadu puta. Foto koristi film tipa FT-41p (Rusija).

Za dijagnozu Chlamidijama lezije sinusa je potrebno koristiti posebne dijagnostičke algoritam.

Osnovni princip dijagnostičke pretrage je tri faze.

U prvoj fazi studije skrininga serumu bolesnika sa sinusitisa za otkrivanje hlamidija antitijela ukazuje u toku infekcije ELISA i RNIF i verifikaciju hlamidija vrsta (C. pneumoniae, C. trachomatis, C.psittaci).

U drugoj fazi preko PIF i PCR se vrši direktno u dijagnostici Chlamidijama žarišta (nosne šupljine i sinusa) i periferne leukocita u krvi da se uspostavi uopštene infekcije.

U trećoj fazi dijagnoze pomoću CM odrediti osjetljivost na antibiotike agenata.

Ovaj algoritam je testiran u anketi od 97 pacijenata, uključujući i one s kroničnim maksilarnih sinusa čini 28 ljudi, 39 su bili sa relapsirajućim akutnim maksilarnih sinusa i 30 - ne pate od bolesti gornjeg respiratornog trakta i ušao u kontrolnoj grupi. Komparativna informativnosti različitih laboratorijskih metoda za dijagnozu Chlamidijama infekcije među grupama ispitanika podataka prikazanih u tabeli.

Komparativna informativnosti različitih laboratorijskih metoda za dijagnozu Chlamidijama infekcije u sinusitis

metod	Chlamidijama infekcije
metod	S. pneumoniae	C. trachomatis	C. psittaci	samo
Mutual Fund	59 (60,7%)
PCR	35 (36%)	8 (8,2%)	-	43 (44,3%)
KM	31 (31,9%)	11 (11,3%)	-	42 (43,2%)
RNIF	25 (25,7%)	14 (14,4%)	7 (7,2%)	46 (47,3%)

Kao što se vidi iz podataka prikazanih u materijalu od pacijenata sa dijagnozom klamidiju poliklonalnim grupa specifičnih anti-Klamidija antitijela u 59 (60,7%) bolesnika. Međutim, korištenje drugih dijagnostičkih tehnika omogućila njihovu potpunu identifikaciju. Kada je postavljen približno jednaka učestalost otkrivanja S. pneumoniae i pacijenti C. trachomatis u materijalima sinusitisa (PCR - 44,3% CM - 43,2%, RNIF - 40,2%).

Prema tome, rezultati komparativne studije metoda za dijagnozu Chlamidijama infekcije otkrila visoke frekvencije otkrivanja klamidije s maksilarnih sinusa koja omogućava definiciju "Chlamydia etiologije sinusitis" i identificirati niz kliničkih karakteristika, karakteristika ove grupe bolesti.

"Bolest, ozljeda i tumora maksilofacijalne"
ed. Aljaska Iordanishvili

Udio u društvenim mrežama:

Povezani