Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.

Moskva, Federal Center Državnog sanitarne i epidemiološke Ministarstvo zdravlja 2000UtverzhdayuGlavny gosudarstvennyysanitarny vrachRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO24 April 2000 godaData Jul 2000 vvedeniya1 goda2.3.2. Hrana i DOBAVKIMEDIKO hrane - Biološko ocjenjivanje prehrambenih proizvoda dobivenih od genetski MODIFITSIROVANNYHISTOCHNIKOVMETODICHESKIE UKAZANIYAMUK 2.3.2.970-001. Razvijen od strane instituta za ishranu (Tutelian VA -Head, Aksyuk IN, Vasiljev AV, Vorobyev LS, VysotskiyV.G., Volgarev MN, Korolev AA, Kravčenko L . .U, Maganova NB, Mazo VK, Pokrovskaya GR, Sokol'nikov AA, Sorokin EY, TyshkoN.V.) - vakcine i serume Instituta. II Mechnikov medicinskih znanosti (Semenov BF, Britsina MV, Zaharova NS.) - (. GG Onishchenko, Petukhov AI) Ministerstvomzdravoohraneniya RF (Odjel sanitarne inspekcije) - Moskva-medicinskoj akademiji. IM SechenovaMinzdrava Rusija (barela NP, Sukhanov bp.) - Centar"bioinžinjeringa" RAS (Skryabin KG, Kuznetsov BB, Dorokhov DB, Asadov UE.) - Medical - Genetski centar RAMS (Shishkin SS-a.) - Moskva State University of Applied biotehnologiiMinisterstva opšte i stručno obrazovanje RossiyskoyFederatsii (Rogov IA, Scarce NG Gurova N., čvorovi VV.). 2. Odobreni April 20, 2000, donesen Glavnymgosudarstvennym sanitarni liječnik Ruske Federacije od 1. jula 2000g.3. Vpervye.1 predstavljen. Opšte odredbe i obim primeneniya1.1. Metodološke smjernice set trebovaniyakprovedeniyu medicinski - biološka ispitivanja prehrambenih proizvoda dobivenih od genetski modificiranih istochnikov.1.2. Smjernice imaju za cilj da uchrezhdeniysanitarno - epidemiološka služba Ruske Federacije, izvođenje državni sanitarni - epidemiologicheskiynadzor, kao i druge institucije akreditovane naprovedenie rad u ovoj oblasti.1.3. Zahtjevima ove metodološke ukazaniyahv za proizvode izvedene iz genetski modifitsirovannyhistochnikov primijeniti u fazi proizvodnje, higijenski pregled, registracija država, nabavku, uvoz u zemlju i realizatsii.1.4. Metodološke smjernice su dizajnirani tako da obespecheniyaedinogo, nauke - pristup baziran na procjeni kvaliteta ibezopasnosti prehrambenih proizvoda potiče iz geneticheskimodifitsirovannyh izvora, razvojne faze, ispitivanje registracije igosudarstvennoy produktsii.1.5. Proizvođač novih prehrambenih proizvoda dobivenih izgeneticheski modificirani izvora namijenjen dlyarealizatsii na teritoriji Ruske Federacije treba da izdaju eemarkirovannoy u skladu sa utvrđenim poryadkom.2. Normativni ssylki2.1. savezni zakon "Na sanitarnoj - epidemiologicheskomblagopoluchii stanovništvo" od 30. marta 1999. godine D.2.2. "Osnove zakonodavstva Ruske Federacije o građanima ohranezdorovya" od 22 jul 1993 G.2.3. savezni zakon "O izmjenama i dopunama Rusija vZakon "Zaštita potrošača" i KodeksRSFSR o prekršajima" 9. januara 1996. godine D.2.4. Uredba o državnim sanitarne i epidemiološke regulacije, koji je odobren od strane Ruske Federacije PostanovleniemPravitelstva na 5 Jun 1994 N 625.2.5. Propisi o državnom sanitarne i epidemiološke službe Ruske Federacije, utverzhdennoePostanovleniem ruske vlade od 30. Juli 1998. N 680.2.6. Rezolucija glavni državni sanitarni vrachaRossiyskoy Rusija N 7 od 6 April 1999 "O proceni poryadkegigienicheskoy i registraciju proizvodnje hrane, poluchennoyiz genetski modifikovane izvora".3. Pravila i opredeleniyaPischevaya proizvodi - hrana sirovina, hrane produktyi komponenty.Prodovolstvennoe njihove sirovine - objekata bioloških, organskog i anorganskog porijekla koji se koriste dlyaproizvodstva produktov.Pischevoy -produktzhivotnogo prehrambenih proizvoda, povrća, mineralna ili biosintetičkih porijekla, prednaznachennyydlya ljudsku potrošnju, i po obimu i vpererabotannom vide.Komponent - životinjske tvari, povrće, mikroba ilimineralnogo porekla i p rirodnye sintezirovannyepischevye ili aditivima koji se koriste u proizvodu pripreme ili proizvodstvepischevogo ili su prisutni u gotovom proizvodu u iskhodnomili vide.Kachestvo modifikovane hrane - skup karakteristika koje određuju potrošača svojstva, kvaliteta hrane ibezopasnost produktsii.Bezopasnost prehrambenih proizvoda - ne postoji opasnost dlyazhizni i zdravlje sadašnjih i budućnost pokoleniy.Gennaya Inženjering - sekcija za molekularnu genetiku u vezi stvaranja stselenapravlennym u vit0ro novi com Inácio geneticheskogomateriala (rekombinantne DNA) sposoban za reprodukciju ćelija ifunktsionirovaniyu - hozyaine.Geneticheski modificirani organizam - neskolkoorganizmov ili organizam, bilo noncellular, jednoćelijskih ili mnogokletochnyeobrazovaniya sposoban kvosproizvodstvuiliperedachenasledstvennogo genetskog materijala različitih od prirodnyhorganizmov dobijeni pomoću genetičke metode inženjeringa isoderzhaschie genetskog - inženjering materijala, uključujući gena, njihove fragmente, ili kombinacija genov.4. Postupak za higijensko ekspertizyi stanje registracija prehrambenih proizvoda dobivenih od genetski modifitsirovannyhistochnikov4.1. Svi prehrambeni proizvodi dobijeni iz izvora geneticheskimodifitsirovannyh prolazi higijensko ispitivanje poryadke.4.2 Trenutno instalirani. Provođenje higijensko ispitivanje gosudarstvennoyregistratsii i prehrambenih proizvoda pripremljeni od geneticheskimodifitsirovannyh izvora se vrši prema sporyadkom, Rusija postaviti Rezolucija Glavni gosudarstvennogosanitarnogo liječnika iz 7 06/04/99 N "O proceni poryadkegigienicheskoy i registraciju proizvodnje hrane, poluchennoyiz genetski modifikovane izvora".4.3. Organizacije, kompanije su u centru sanitarno-epidemiološke normalizacije, higijenske certifikaciju iekspertizy Ministarstva zdravlja dokumenata i materijala ruski Federatsiikomplekt, uključujući: - aplikacija (pismo) da sprovede higijenski registracija procjena igosudarstvennoy prehrambenih proizvoda izvedenih izgeneticheski modificirani istochnikov-- materijala odražava medicinski - genetski pischevoyproduktsii procjena dobiti iz genetski modificiranih istochnikov-- materijala odražava tehnološki skie pischevoyproduktsii svojstva dobijenih od genetski modificiranih istochnikov-- materijala odražava medicinskih - Biološko ocjenjivanje pischevoyproduktsii dobijenih od genetski modificiranih istochnikov.4.4. Obim i program rada na procjeni kvalitete ibezopasnosti prehrambenih proizvoda izvedenih iz geneticheskimodifitsirovannyhistochnikov određuje rezultatamekspertizy predstavio materialov.4.5. Rad na procjenu kvalitete i bezopasnostipischevyh proizvodi dobiveni iz genetski modifitsirovannyhistochnikov, firma - proizvođač daje uzorke proizvoda, vkolichestve potrebno dlyaprovedeniyapolnogoobemaissledovaniy.4.6. Na temelju ispitivanja pruža imaterialov dokumenti i rezultati medicinsko - genetski, tehnološki i medicinski - biološka istraživanja produktsiitsentr sanitarno - epidemiološke norme, gigienicheskoysertifikatsii i stručnost ruskog Ministarstva zdravlja priprema blankregistratsionnogo certifikat (ili obrazloženo mišljenje obotkaze) i prenosi ga na potpis Odjela gossanepidnadzoraMinzdrava Rusije. Potvrda o registraciji podpisyvaetsyaGlavnym stanje sanitarni liječnik Ruske Federacije, odsustvo AB - Glavni državni sanitarni i epidemiološki odjel, zamjenik načelnika gosudarstvennogosanitarnogovrachaRossiyskoy Federatsii.5. Medico - genetski procjenu prehrambenih proizvoda dobivenih od genetski modifitsirovannyhistochnikovNeobhodimost provesti bilo istraživanje o dannomurazdelu za svaku određenu vrstu hrane, poluchennoyizgeneticheskimodifitsirovannyhistochnikov određuje stručnjak centar "bioinžinjeringa" Ruske akademije nauka. Tehnike opisane u točkama 5,1-5,3 su potrebne priprovedenii medicinski - mogu se preporučiti genetskog vrednovanja prehrambenih proizvoda dobivenih od genetski modificiranih istochnikov- metode prikazane u stavku 5.4, kakdopolnitelnye.5.1. RAPD genotipovNeobhodimoe analiza opreme i reaktivyOborudovanie i prinadlezhnostiMikrotsentrifuzhnye tip Eppendorf tube i 1.5 ml 0.5 (dostupan od DNK-ase RNK-ase firma Alpha) teflon tučak i / ili staklenim štapićem pod razmermikrotsentrifuzhnoy epruvete od 1,5 ml *>tabelu mikrocentrifuga Eppendorf (teta 20 200000ob. / min.) *>Automatska varijabla volumen mikropipeta (Classic / student 0,5-10 mkl- 5 - 40 mkl- 200-10000 L) za mikropipete tips (tip "mikro" i konvencionalne) Hladnjak (uzorak hladnjak) *>Floating stativ - "splav" probirokVesy Microcentrifuge za 0,5 kgMikroanklav - "pritisak-štednjak"BidistillyatorDNK-biciklista ("Amplituda-4") Elektroforetska opreme odvajanje Dnkv fragmenata po agaroznom gelu: izvor napona za elektroforezu (NPC 300) *> i uređaj za horizontalnu mini - elektroforeza (mini-kamera) *>UV lampa za vizualizaciju rezultata DNK elektroforeza (transiluminator - UVT) *>Tip SLR "zenit" narančasta svetofiltromFotoplenka tip "Mikrat-200"(termostat"temo 24-15") Shaker (3D) tip Mikrovstryahivatel cijevi Vortex (teta 2 ili 4) *>RN-metrFitotron kultivaciju (fitotronu-99) Tabela laminarno kutija (BL-1) ------------------------------- - *> Označavanje proizvoda koji su proizvedeni na kompaniju"Biokom", Moskva, Rossiya.Neobhodimye reagense i rastvoryReaktivyTris (hidroksimetil) aminometaneHCl konts.EDTANaClSDSAtsetat kaliyaEtilovy alkohol 96% Agaroza za elektroforezaBromisty etidiyBornaya kislotaBromfenolovy siniyGlitserinNabor za DNK pojačanje (Biomaster - Srl - Italija - Rusija, Moskva) Priprema glavni rastvorov1 M Tris pH-7,5 . Rastvoriti 121.1 g TRIS u 800 ml vody.Dovesti pH na željenu vrijednost dodavanjem kontsentrirovannoyHCl i dovesti zvuka na 1 litru. A rješenje prosterilizovat.0,5 M EDTA pH-8,0. Na 186,1 g EDTA dodati 800 ml vody.Dovesti pH do 8,0 NaOH.5 M NaCl (reagens razred ili analitičke razred). 29.22 g NaCl otopljen u 80 ml vode i dovesti volumen do 100 ml, prosterilizovat.10 posto SDS-a. Otopite 10 g SDS-a u 90 ml vode, chtobyuskorit raspada, rješenje se može zagrijati do 60 stepeni. C. DovestipH 7,2 dodavanjem nekoliko kapi koncentrirane HCl idovesti do 100 ml. Upozorenje! Kada vaganje SDS litsomasku staviti na, s obzirom u kontaktu sa sluznicu nazofarinksa etotletuchy prah je veoma razdrazhenie.Ekstraktsionny puferu (200 mM Tris-HCl pH-7,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 posto SDS). Da bi se pripremio 100 mlekstraktsionnogo tampon zahtijeva 20 ml 1 M Tris-HCl (pH-7,5), 5ml M NaCl, 5 ml 0,5 M EDTA i 5 ml 10 posto SDS-a. Donijeti rješenje do 100 vodoyobem ml.5 M kalij acetat. 49,1 g kalij acetata otopljenog u 80 ml vode kako bi volumen do 100 ml.70 posto etanola. Da bi se pripremio 100 ml rastvoratrebuetsya 73 ml 96% etanola i 27 ml vody.TVE 5X pufera (0,089 M Tris - baza bornayakislota 0.089 M, 0.002 M EDTA pH-8,0). Na 1 litar rastvora potrebnih 54 gTris, 27,5 g borne kiseline (analitički čist), 4.6 g Na2EDTAx2H20. Dlyaprigotovleniya elektroda-0,5x TBE buffer mora stokovyybufer razrijeđen 10 puta s destiliranom vodoy.Bufer za nanošenje uzorka 6X (0,25-bromfenolovyysiny posto, 30 posto glicerol, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Dlyaprigotovleniya 10 g pufera zahtijeva 2,5 mgbromfenolovogo plava, 3 g glicerola, 0,1 ml Tris, 0,02 ml 0,5 MEDTA pH-8,0.Rastvor Ethidium bromid (10 mg / ml). Otopite 1 gbromistogo Ethidium 100 ml vode. Za vizualizaciju DNK u otopini agaroznomgele koristi u koncentraciji od 5 .mu.g / ml. Upozorenje! Vsemanipulyatsii sa Ethidium bromid i DNK rješenje za obavljanje vperchatkah.Vydelenie tkaniDlya iz biljnog tkiva proizvodnju biljnih sjemena, gomolja ili drugoyrastitelny materijala klijavih pod kontroliranim uvjetima dopolucheniya svježeg lišća ili biljnim tkani.Vysechku list dobiti zatvaranjem poklopca tipaEppendorf epruvete od 1,5 ml ili 10-14 mg tkiva (kada vysechkupoluchit teško) v400mlekstraktsionnogo intenzivno homogenizirane buffer (potrebno rješenja i reagensi) sa pomoschyuteflonovogo pestika.Primechanie. Izolirati DNK je bolje uzeti mladih listova smyagkimi tkiva bez vidljivih tragova uništenja. Teflon pestikdolzhen pridržavaju zidove cijevi. Pokušajte maksimalnominimizirovat vremena homogenizacije. Homogenizacije olova dointensivnogo bojenje zelene ekstrakcije bufera.Probirki sa homogenata Shake za 5 sekundi. na Vortex.Pomestit ultrathermostat cijevi i inkubirajte na 65grad. C 15 min., Sadržaj se periodično miješajući probirkimyagkim pokachivaniem.Dobavit u epruvete u 200 .mu.l 5 M kalij acetat (prethodno ohlađen u frižideru) sadržaj epruvete i tschatelnoperemeshat svjetlo vstryahivaniem.Inkubirovat uzorka u ledenu kupku za 15 min.Tsentrifugirovat uzorak u stola centrifuga na 16.000 g 20min. na sobnoj temperature.Ostorozhno izabrati 400 .mu.l supernatanta u svježe epruvete iosadit dva toma od 96 posto etanola (hlađen) po mešajući lagano. U ovom trenutku, možete promatrati obrazovaniemalenkoy "meduza" ili fino raspršeni suspenzije. Ostavite probirkina sto 5 uzoraka min.Tsentrifugirovat u stacionarni centrifugu na 16.000 g, 10min. na sobnoj temperature.Osadok DNK ispiranja rashlađeno na temperaturi od -20 stupnjeva. C-70 protsentnymetanolom i centrifugira kao što je opisano u prethodnom punkte.Rekomenduem ponovite ovaj postupak jednom raz.Slit supernatant i pomoću mikropipetkimaksimalno uklonili ostatke tečnosti iz DNK probirki.Osadki suho otvaranjem poklopca probirok.Primechanie. Pazite da ne preteranog sušenja DNK padavina, DNK t.k.peresyhanie dovodi do slabe rastvorljivosti u vode.Rastvorit DNK u 100 l sterilne redestilovano koncentracija ideionizirovannoy vody.Izmerit DNK.Amplifikatsiya genomske DNKAmplifikatsiyu genomske DNK se provodi u 25 ul reakcijske smjese (67 mm Tris-HCl pH-8,8- 16 mm (NH4) 2SO4- 2 mM MgCl2- 0,01% Tween-20- 200 mm svaki dNTP- 10:00 / ml 25 praymera- mkggenomnoy DNK i 0,5 jedinica. Taq-polimeraze) . Sve komponente osim DNK se isporučuje u kompletu za pojačanje Biomaster.Sterilnye kompanija Eppendorf-cijev 0,5 mL i staviti vshtativ podpisat.V jedan od cijevi da formiraju reaktsionnuyusmes sekvencijalno dodavanje komponenti, kao što je navedeno na crtežu reakcija mješavina primere.Primer + ------------------------------ + ------------------ + -------------- + | Sastojci | U jednom uzorku, l | 7. uzoraka l | + ------------------------------ + ---- -------------- + -------------- + | H2O | 16,8 | 117,6 | + ------------------------------ + ---------- -------- + -------------- + | reakcija tampon bez | | || MgCl2 (10X) | 2.5 | 17,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- + -------------- + | MgCl2 | 1 | 7 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | mješavina dNTP`s | 2 | 14 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | Primer (4 AU / ml) | 0,5 | 3,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- + -------------- + | termostabilne DNA polimeraze | 0,2 | 1,4 || (4 U / ml) | | | + ------------------------------ + ----------------- - + -------------- + | DNK | 2 | - | + ------------------------------ + ---------------- - + + -------------- Rastvorite reakcija mješavina u odgovarajućim cijevi probirkam.Vnesti genomske DNK i pipetom dlyaperemeshivaniya proby.Poverh reaktsionnoysmesinasloitneskolkokapelmineralnogo ulje (oko 17 .mu.l), što uklanjanje mjehurića cijevi vtechenie sekundi centrifugira na stacionarni centrifugu, a štand perenestiproby DNK.Ustanovit thermo i pokrenite sljedeću program DNA pojačanja: 1 ciklus: 94 stupnjeva. C - 3 min.- 36 stupnjeva. C - 1,5 min.- 72 stupnjeva. C- 1,5 min.- II.33 ciklusa: 94 stupnjeva. C - 0,3 min.- 36 stupnjeva. C - 72 stupnjeva 1,5min.-. C - 1,5 min.- III - 1 ciklus: 94 stupnjeva. C - 0,3 min.-36 st. C - 1,5 min.- 72 stupnjeva. C - 10 min.Primechanie. Zbog analizarekomenduem korištenja velikih chuvstvitelnostiRAPD samo jedan thermo i tolkoodnim odabrani set reagensa za DNK pojačanja. Vsereaktivy za pojačanje i DNK preparata mora se čuvati vmorozilnoy komori na 20 stupnjeva. C. refreezing (ispod -20 grad.C) priprema termostabilne rezultati DNK polimeraze u gubitku eeaktivnosti.Elektroforez elektroforezom na agaroznom gelu i vizualizaciju produktovamplifikatsiiDlya Priprema 2 posto agaroznom potrebno dodati 1 gagarozy 0,5x TBE tampon do 50 ml i dobro promešajte. pljoska je zatvoren folgoy.Kolbu agaroznom staviti u mini-autoklav ili ekspres lonac iavtoklavirovat 15 min.Rasplavlennuyu agaroznom se hladi do 50 stepeni. C i prelijte vpodgotovlennuyu gel kalup, izbjegavajući formiranje mjehurića vgele. debljina gel bi trebao biti 0,5-0,7 sm.Cherez 30 -. 40 minuta, kada se formira gel, uklonite grebenkui prenijeti ga u komoru za elektroforezu, predvaritelnozapolnennuyu TBE tampon 0,5x. Gel treba da bude potpuno pokrytbuferom 1-2 mm.K 2 ul pufera dodati 10 - 13. l reaktsionnoysmesi sadrže DNK pojačanje proizvoda peremeshatpipetirovaniem i pažljivo primijeniti na bunarima jednog agaroznom gelu. U ekstremnim lunkunanesti molekularni marker massy.Primechanie. Tipično, molekularni marker massyispolzuyut lambda faga DNK tretirane ograničenje enzim Hind III ili Pst I iEcoR I.Elektroforez nastupio na 50 V (5 V / cm) bromfenolovyysiny sve dok se ne dostigne nivo od 1 cm od ruba gela. Obično elektroforezdlitsya 3-3,5 chasa.Dlya vizualizaciju pojačani fragmenti DNK gelpomeschayut u Ethidium bromid rješenje (5 mg / ml) i provodyatokrashivanie za 20 min. na kachalke.Primechanie. Uz rješenje Ethidium bromida i izvoditi u boji gelemneobhodimo perchatkah.Chtoby smanjiti pozadinu fluorescencije izazvane bromistymetidiem, gel je dva puta oprati destiliranom vodom pripostoyannom pokachivanii.Primechanie. Produžena pranje gela može dovesti kischeznoveniyu slab područja i erozije spektra zbog diffuzii.Gel postavljen na filter transiluminator i pogled vprohodyaschem UV zračenje kroz zaštitne ograde i posebne zaschitnyeochki. Ako je potrebno RAPD spektara oranzhevyyili fotografisao kroz crveno filter na tip filma "Mikrat". Fragmentyamplifitsirovannoy DNK nakon tretmana sa Ethidium bromid pod UV budutflyuorestsirovat naranče tsvetom.Primery pomoću RAPD analiza za identifikatsiigenotipov kartofelyaV papir 19 koristi decameric kapisli. krumpir Spektryamplifitsirovannoy DNK imala velike kolichestvofragmentov različite dužine. RAPD analiza spektara razreda kartofelyas pomoću prajmera PTA-19 otkrila važnih vrsta polimorfizmmezhdu (Sl. 1) *>. Dobijeni podaci pokazuju neke varijabilnost osuschestvennoy intravariety starinnyhotechestvennyh sorti. Koristeći chislapraymerov ograničena na raznim razreda dobiti RAPD spektara spetsifichnyedlya posebnu klasu. Analiza spektara omogućava DNK vyyavitneznachitelnye razlike između usko povezana razreda čak Techto su proizvedeni kao somaklonalne varijante jedne te analize identifikaciju slučajeva BTEX se zheroditeley.Osnovannaya DNK se može koristiti kada sorte ne može pouzdano istaknuti porezultatam elektroforeze proteina, uključujući i analizu vsehstadiyah tokom razvoja biljke. razvio brza metoda za izolaciju DNA iz glazkovkartofelya i RAPD tehnike kako bi se smanjila vremena i stoimostanaliza. Identifikacija DNK sorte analiza može se sdelanamenee od 24 ch.Kontrol somatske izmjene u genomu i propagiraju invit0ro transformiše krompira na istoj kapisle dokazalvysokuyu efikasnost DNK analize u identifikaciji genotipovrasteny (Sl. 2) *>.-------------------------------- *> Crteži nisu privodyatsya.Zaklyuchenie. Predložene micromethod izolaciju genomske DNK izrastitelnogo materijala za RAPD-analiza je brz, ekonomičan, jer ne zahtijeva skupu opremu ireaktivov u odnosu na druge molekularne metode otsenkirastitelnyh genotipova, kao i jednostavan za implementaciju. Rastitelnyymaterial se može uzeti kao iz oblasti staklenika i uzgaja vlaboratornyh uvjetima. To ne zahtijeva micromethod bolshihkolichestv biljnih tkiva (1-20 mg), što je bolshimpreimuschestvom u odnosu na druge metode, jer je postrojenje za daljnje pozvolyaetsohranit raboty.Perechislennyedostoinstva ovu metodu čini vrlo povoljno kada se radi sa velikim brojem uzoraka za masovnu analizu i priizuchenii pojedinačnih genotipova rasteniy.5.2. Određivanje da li transgenih Dnkv gotovih proizvoda pitaniyaStandartno opredeleniyanalichiyachuzherodnogo prihvaćenim metodama genetskog materijala i svoje proizvode yavlyayutsyaimmunologichesky analiza i identifikacija transgenih DNK reakcija pomoschipolimeraznoy (PCR). Ova studija pischevyhproduktov, proizveden počevši selskohozyaystvennoesyre podvrgnut toplinske obrade, može dati immunologicheskiyanaliz nestabilan i slabo vosproizvodimyerezultaty kao denaturiranog proteina često nisu sposobnyvstupat specifične reakcije sa antitela na maternjem belku.Polimerazno - lančanu reakciju u tom smislu ima tempreimuschestvom da termička obrada sirovine ne utječe nakachestvo DNK kao predložak i stoga se nalaze u produktahpitaniya i polufinalu max rezidualni DNK sirovina priprovedenii PCR daje iste rezultate kao izvorne kriterij DNK.Vtorym za odabir PCR kao metod za analizu osjetljivosti yavlyaetsyavysokaya nadmašujući najmanje dvaporyadka metodov.Pomimo poznat imunološki osjetljivost PCR je mnogo jeftinije i boleestabilnym metoda u odnosu na druge metode analize. Odnimnemalovazhnym Druga prednost PCR je da sintetički oligonukleotidi koristiti vreaktsii ako se pravilno vyboremogut se primjenjivati ​​za analize različitih transgena da u slučaju imunoloških metoda nevozmozhno.Metody utvrđivanja da li je transgenih Dnkv gotovih prehrambenih proizvoda putem polimeraznoytsepnoy reaktsiiVydelenie produktaV DNK je metoda ispitivanja odabrana raspodjele DNK odlučujuću ulogu igraetsoderzhanie nafte u prehrambenim proizvodima. Sa povećanim soderzhaniimasla (čokolada, rafiniranih biljnih ulja, itd) Dodatna ekstrakcija suspenzija nepolyarnyhrastvoriteley vodom. Zbog toga je moguće prenijeti DNK sadržane vpischevom proizvoda u vodenoj fazi, u kojoj je čišćenje proizvoditsyadalneyshaya. Za završno čišćenje ispolzuetsyaoriginalnaya tehnika razvijena u centru "bioinžinjeringa"Konvencionalno, dužina fragmenta PCR u identifikaciji transgenih DNK neprevyshaet 1000 parova, međutim nizhesleduyuschihmetodik je osnova za izolaciju i pročišćavanje procedure za poluchitdostatochno čist DNK pripreme za PCR. Vtorymkriteriem tehnike uzorkovanja bio je zahtjev da se smanji vrijeme provedeno na dodjelu jedne DNK.Metodika1 droge. 0,5 g uzorka hrane je homogenizirano sa teflon tučak ili pomoschisteklyannogo u 0,5 ml pufera A (100 mMt0ris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 10 mM beta-merkaptoetanola) .2. Nakon homogenizacije, 100 .mu.l od 20% SDS-a. Smestschatelno miješati i inkubirani za 20 - 30 min. na 65 stepeni. C.3. Ohladi do 4 stupnjeva. C, dodaje se 0,3 ml 5 M kalij acetata, pokrenuto vortex miješalici i centrifugira 10 min. na 15000ob. / min. u mikrocentrifuga na sobnoj temperature.4. Na supernatant je dodan 1 ml smole Wizard MaxiPreps (Promega, SAD), a mješavina je inkubirani 10 min. na 25 stupnjeva. C.5. Zatim, što rezultira smjesa se pumpa kroz mini kolonkuWizard (Promega, SAD), isprana s 2 ml 80 posto izopropanol, otzhimayutostavshiysyavmini-kolonkeizopropanoltsentrifugirovaniem u mikrocentrifuga (15.000 okr. / Min., 2 min.). 6. Microcolumn dodao u 50 .mu.l destilirane vode zagrijava na 65 stupnjeva. C.7. Inkubirati mini - kolona vode 10 minuta. na 65 stepeni. C, iotzhimayut DNK rješenje u čistu sterilnu mikrotsentrifuzhnuyuprobirku centrifugiranja u mikrocentrifuga (15.000 o / min za 2 min ...) Ovisno o sadržaju DNK određene holdinga hrane jedinici polimeraze -. Lančana reakcija volumen 50mkl zahtijeva 2-20 .mu.l dobijenog DNK.Obraztsy pripremu hrane s povećanim sadržajem ulja peredvydeleniem DNK bude podvrgnut dodatnim ekstraktsiiemulsiey kloroform vode.Dlya od 0,5 g proizvoda je homogenizovanu smesi0,5 ml pufera a i 0,5 ml klorofila jaram 20 i homogenata je inkubirana min.pri 56 stupnjeva. C. Tada je ohlađena do 4 stupnjeva. C i tsentrifugiruyut10 min. na 15.000 okretaja u minuti. / min. u mikrocentrifuga na sobnoj temperature.Vodnuyu fazi prikupljeno je i prebačen u čistu epruvetu. Daleeprodolzhayut od koraka 2 metodiki.Vybor prethodnim kapisle za PTsRDlya precizno utvrđivanje prisustva transgenih DNK biti pružanje pruža informacije molekulyarnoystrukture transgene umetak, odnosno njegove nukleotidnayaposledovatelnost. Ovaj zahtjev je predstavljen canwas precizno identifikovati prisustvo specifičnih geneticheskoykonstruktsii. U ovom slučaju, sintetički oligonukleotidi će se sintetiziraju PCR dlyaprovedeniya tako da prisustvo vyyavitfakt u transgene kodiranja regiji. Dužina prianalize specifičnih početnica koristi treba biti najmanje 25 parnukleotidov da se izbjegne pojava kao rezultat reakcije proizvoda PTsRnespetsificheskih slučaju nemozhet biti predstavljeni takve informacije iz nekog razloga (npr firma - napajanje procesora proizvoditelproduktov je samo proizvodimogodrugoy organizacija transgenih sirovina ) provoditproverku je potrebno za prisustvo luči proizvoda testiranih DNKnabora standard izraz kaseta koristi u m rovoypraktike za proizvodnju transgenih biljaka. Za one otnosyatsyapraymery za identifikaciju gena selektivno marker otpor (neomicin otpor gen NPT II i higromicina HPH), atakzhe standardno koristi područja promotora (E35S promoter virusatsvetnoy kupus, itd) .Vybor uvjetima PTsRDlya analize koristeći standardne prajmera na svijetu ispolzuyutobscheprinyatye uvjetima PTsR.Dlya slučajevima specifičnih početnica provedeniyaPTsR uvjetima za izbor se vrši za svaki slučaj otdelno.Apparatura se primjenjuje u PCR analiza eerezultatovAnaliz prisustvo transgene ubacite DNK sadržane vproduktah vlast vrši na DNK thermo "VP-4"proizveden "Biocom"Moskvi. Kaljenje obraztsovosuschestvlyaetsya na suhu termostati "termo 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Moskvi. Za PCR Taq proizveden ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Moskvi. Analizproduktov PCR je izvedena pomoću ograničenja analize etihproduktov agaroznom gelu i rezultirajući uzorak na posleduyuschegofotografirovaniya transiluminator firma UVTIproizvodstva "Biocom"Moskva, na filmu "Mikrat -Izopan" koristite fotoaparat "zenit" ili u digitalnom obliku pripomoschi digitalni fotoaparat "Kodak DC 120".Fotootpechatki ili otisaka je na laserskim pisačima sa rezolucijom od najmanje 600 tačaka po inču, treba priložiti kprotokolu od ispytaniy.5.3. PCR identifikacija blizkorodstvennyhshtammov bakteriyV sadašnje tehnike molekularne biologije su zasnovani reakcija naprimenenii polimeraze (PCR) su sve boleeshirokoe koristi u dijagnostičke svrhe i izraziti - analizaraznoobraznogo biološkog materijala. Intenzivne metode razvitiepodobnyh zbog vrlo veliku osjetljivost PCR, mogućnost brze rezultate (u odnogorabochego dana), niski troškovi dobivenih rezultata (u odnosu na druge metode) i prerade (vozmozhnostyuorganizatsii trenutna radna grupa praktično lyubyhusloviyah do mobilnih express - laboratorija) .Ostali molekularne - biološke metode ili zahtijevati dlyasvoey realizatsiiorganizatsiispetsialnooborudovannyhdorogostoyaschih laboratorije ili osigurati cut ultaty sa nizkoydostovernostyu.Tipichny primjer nemogućnosti dostovernoyidentifikatsii - filogenetske analiza blisko srodnih vrsta ponukleotidnoy 16SpPHK sekvence gena. Takve analizyavlyaetsya uobičajeno kompletan opis novootkrivenih vidovbaktery ali daje mali pouzdanost popytkerazlichit blisko srodnih vrsta, kao što se javlja u industrijskim sojeva sluchaeidentifikatsii St0reptomyces izgruppy B.anthracis.Metod bacili ili bakterije identifikacija pomoću PTsRVybor metodaSredi zasniva na upotrebi PCR molekularne - biologicheskihmetodov studije biodiverziteta najpogodniji za tseleyidentifikatsii bakterija je metoda tzv DAF-PCR, razvijen od strane Caetano - Annoles (Caetan o - Annoles G, Bassam Kao J, Gresshoff PM (1991) DNA pojačanje otisci prstiju pomoću veryshort arbit0rary oligonukleotida kapisle Bio / Technology 9: 553 -556) .. Što se tiče druge metode, oni ili zahtijevaju slishkomobshirnoy informacije o strukturi genoma određenog organizma (direktnu detekciju naprezanja - specifičnih gena), ili da nepolnuyudlya identifikaciju informacija blisko srodnih vrsta (RAPD-PCR, Dalp-PCR), ili previše složena i skupa, a ne mogu bytrekomendovany za široku upotrebu (AFLP-PCR) .Edinstvennym usko grlo u DAF-PCR je izbor odgovarajućih dlyatochnoy identifikacije kratak oligonukleotida praymerov.Vybor praymerovRazrabotannoe vtsentre "bioinžinjeringa" RAS programmnoeobespechenie za sekvenca nukleotida analizu polnyhgenomnyh bakterija omogućava izbor oligonukleotidnyhpraymerov za DAF-PCR, pruža identifikatsiyubaktery povjerenje na nivou naprezanja, što odgovara individualnymrazlichiyam da ljudi i drugih viših eukariota. Takve rabotaprovedena za identifikaciju blisko povezanih bakterijskih grupa. anthracis, za koje identifikaciju pomoću standartnyhmetodov (filogenetske analize nukleotida posledovatelnostigena 16SpPHK) je bezuspeshnoy.Vybor uvjetima PTsRUsloviya reakcije određuju stupanj rezultata preciznosti ivosproizvodimosti i treba biti održana za konkretnoygruppy bakteriy.Sozdanie elektronske baze podataka dannyhDlya potpunu i pouzdanu identifikaciju specifičnih mikroorganizmaneobhodimo stvoriti elektronske baze podataka o određenom gruppebaktery, koja sadrži informacije o maksimalnom WHO mozhnomchisle razne dostupan kao čiste kulture ili sojeva kollektsiitipovyh bakteriy.Vydelenie DNKNaibolee pouzdane rezultate u PCR daje DNK vydelennayaneposredstvenno pred usmjeravanje reakcija zamorozhennoybakterialnoy paste metodom Promega kompanija smola (SAD) pomodifitsirovannomu kontakt i Birnoboyma proporcije: - 20 - 40 ul od otopljenih bakterijskih 100mkl mase obustavljena u tampon i (50 mm t0ris HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 50 MKG / ml RNase) .K suspenzija se dodaje 120 .mu.l od pufera za lizu (0,2 M NaOH, 1% SDS) i očekuju bakterijske lizu kao što se vidi rastuće visco stisuspenzii. Nakon toga, bakterijskih proteina i složenih oblomkovkletochnoy zid talože dodavanjem 100 .mu.l od 2.55 m acetata kaliyapri energične trese na vrtlog za 5 min. Zhestkoevstryahivanie vortexed potrebno porvatdlinnuyu bakterijske DNK koji su u prilogu membrane vneskolkih poena, inače pada osadokvmeste sa složenim SDS-proteina. Smeša je zatim centrifugira namikrofuge za za 5 - 10 min. Supernatant je prebačen u mikrocentrifuga za mlprobirku 1.5 koja sadrži 0,75 ml smole "Wizard PCR-Prep"ili "Wizard Mini Prep" društvo Promega. Smeša je temeljito peremeshivayuti se pumpa kroz mini-kolona, ​​smola je isprana talog vmini kolona 2 ml 80% izopropanol, centrifugirani u mikrocentrifuga 1 min. maksimalnom brzinom za uklanjanje ostataka tečnost iminikolonku stavlja u sterilnu 1.5 ml mikrocentrifuga tuba, primjenjuje u malim - kolona 50 l sterilne redestilovano vode i grijani ilideionizovannoy cijevi kolona 5 min. kada 70grad. C. Zatim mini - kolone u cijev se postavlja u mikrocentrifuga za 1 minutu itsentrifugiruyut. pri maksimalnoj brzini za perenosarastvora DNK u epruveti. Opisan način, redoslijed 5 mkgDNK. Veličina rezultat DNK - 3-15 kb, da se odvoji da vpolnedostatochno 16S RNA bakterija (oko 1500 bp priispolzovanii prajmer par 11F / 1492R). Pod uslovom ispolzovaniyasterilnyh rješenja i pribor dobiti DNK mogu biti pohranjeni na + 4 stupnjeva. C za šest mjeseci. Rok trajanja DNK pripreme na 20 stupnjeva. C prelazi 2 goda.Ispolzuemye reagensa i oborudovaniePTsR osuschestvlyaetsyanaDNKamplifikatorah"VP-4"proizveden "Biocom"Moskvi. Kaljenje obraztsovosuschestvlyaetsya na suhu termostati "termo 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Moskvi. Za PCR Taq proizveden ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Moskvi. Analizproduktov PCR je izvedena pomoću ograničenja analize etihproduktov agaroznom gelu i rezultirajući uzorak na posleduyuschegofotografirovaniya transiluminator firma UVT1proizvodstva "Biocom"Moskva, na filmu "Mikrat -"Izopan" koristite fotoaparat "zenit" ili u digitalnom obliku pripomoschi digitalni fotoaparat "Kodak DC 120". Iliottiski fotografske otiske napravio sa rezolucijom od laserski printer nije menee600 dpi, moraju se primijeniti na provedeniyaispytany protokol. Oligonukleotida kapisle sintetisane su u Centru"bioinžinjeringa" RAN.5.4. Metode za određivanje ukupne svoystvgeneticheskoy vstavki5.4.1. Izolacija genomske DNA lančanom reakcijom polimeraze i ponašanja. Da izoluje genomske DNK iz uzorka proizvoda mozhetprimenyatsya fenol - kloroform ili drugi odgovarajući način [124]. Rezultirajući DNK pripreme se čuvaju na minus 70 stupnjeva. C iispolzuyutsya za analizu lančane reakcije polimeraze (NDP). Oligonukleotida prajmera za PCR može biti predostavlenyfirmoy - proizvođač proizvoda ili može biti sintetiziran u skladu sa pozakazu podacima vstavki.5.4.2 strukture. U obavljanju PCR Taq-DNA-polimerazaproizvodstva IBCh. U tipičnoj eksperimentima polimerizatsionnuyusmes zapremine 50 .mu.l je konstruiran tako da sadrži 350 nggenomnoy DNK, 1,5 mm svaki od chetyrehdezoksiribonukleotidtrifosfatov (kompanije MBI Fermentas Litva), 1 jedinicu. Taq-polimeraze. Zatim, da biste polimerizacija mješavina dodao 30pkM par oligonukleotida prajmera u rastvoresleduyuschego tampon sastav: 67 mM Tris-HCl puferu (pH 8,0 na 25 ° C), koji sadrže 16,6 mM amonijev sulfat, 67 mM MgCl2, 10 mm 2-merkaptoetanola, 6 , 7 mm EDTA, i goveđeg seruma albumina vkontsentratsii 170 mcg / ml. Zatim, svaki uzorak je slojevita na 50mkl mineralna ulja i reakcija je izvršena u skladu sa programima posebno prilagođen za site-specific gena DNK thermo vmnogokanalnom "Termtsik" proizvodnja dd"DNK tehnologije" (Moskva) .Ako je potrebno, moguće izvršiti multipleks PCR dlyaanaliza nekoliko fragmenata pojačanje važnih vstavki.Produkty su analizirani elektroforezom vplastine 6 posto poliakrilamid gel (2,5 h na 200 V) DNK-markera je standardni set DNK fragmenata plazmidypBR322 dobiti pod akciju ograničenja enzima Alu 1 (firma MBIFermentas). Bojenje DNK fragmenata se vrši Ethidium bromid. Analiza rezultata i fotografiranja elektroforegrammyosuschestvlyayut u usloviyahultrafioletovoypodsvetkinatransillyuminatore.5.5. metode evaluacije vstavki5.5.1 rad. Određivanje mRNA proizvodi umetanje, u pogonu genom kotorayavvedena koristeći ugnijezditi PTsR.Vydelenie ukupno mRNA preparata iz uzoraka produktaguanidin - tiocijanat - fenol - kloroform metoda [125] iprovedenie naknadne gniježđenje PCR prajmera sa proglašen [126, 125]. Otkrivanje sintetizirani cDNA vpoliakrilamidnom gel elektroforeza bojenjem sa Ethidium bromid [126] .5.5.2. Dvodimenzionalne elektroforetske analize belkov.V raboteispolzuyutsyasleduyuschie reagensi: akrilamid, metilen bisacrylamide, agaroznom, Tris, glicin, natrijev dodecil sulfat, amonijev persulfat, Triton X-100, ditiotrietol Amberlite MB-1,2-merkaptoetanola, Coomassie brilliant blue R-250, plava kumassibrilliantovy G-250, Tween-20, 4-hlor-l-naftol, bychiysyvorotochny albumin - firmi "Serva" (Njemačka) - Tween 20 - firmi"merk" (Njemačka) ampholines pH 3-10, pH 5. - 7., pH 5-8, firmi"LKB" (Švedska) .U kachestveraskhodnyhmaterialovprimenyayutsyatakzhe: nitroceluloza - firmi "Schleicher i Schull"(Njemačka) .Belkovye vsehizuchayuschihsyabiologicheskihmaterialov ekstrakte pripremljene na sličan način koristeći obespecheniyamaksimalnoy solubilize proteina lize rješenje (LR) svysokimsoderzhaniemdenaturiruyuschih agenata - urea merkaptoetanol (ditiotrietola) i Triton X-100. LR - 9 Mmocheviny rastvor koji sadrži 5% 2-merkaptoetanola, 2% Triton X-100, 2% ampholines 3.5 - 10.When prigotovleniiLRsnachala urea rastvorene vdeionizovannoy voda i dalje pročišćen toga AmberlitMV-1. Nakon 10 min. inkubacija Amberlite rastvorumocheviny odvojen i dodao Triton X-100, ditiotrietol (ili 2-merkaptoetanola), ampholines pH 3-10 vađenja rekao proteina uzoraka kontsentratsiy.Pri tkiva su mljeveno škarama ineskolko puta sa hladnom rastvora. Zatemizmelchennuyu tkivo je homogenizirano u čaši homogenizator steflonovym HR tučkom u omjeru od 100 mg u 2 ml tkiva LR itsentrifugiruyut na 700 g 10 min. Razlomak supernatant sadrži rastvara proteina (ekstrakt) je korišten dlyadalneyshey raboty.Dlya analiza proteina pomoću dvodimenzionalnog elektroforeza poO`Farrellu - metoda, sochetayuschiyfraktsionirovaniebelkovizoelektrofokusirovaniem (pervoenapravlenie) -elektroforezom gela u prisustvu SDS-a [128, 129] .Izoelektrofokusirovanie sprovedena u staklenim epruvetama dlinoy150 mm i unutrašnjeg promjera od 3,5 mm. Tube prilagođen vshtativ, donje rupe zapečaćena i Parafilm film zalivayutpolimerizatsionnoy mješavina. Sastaviti polimerizacije smesigotovyat sljedeći reagensi: 1.1. 30 posto akrilamid, 1,6% metilenbisakrilamid.1.2. 20% Triton X-100.1.3. 10 posto persulfate ammoniya.1.4. Anoda tampon za izoelektrično fokusiranje: 0.01 Mfosfornaya kislota.1.5. Katode tampon za izoelektrično fokusiranje: 0,02 m NaOH.1.6. Zaštitna rješenje: 4.5 M uree koja sadrži 1% Triton X-100- 2,5% merkaptoetanola, 1% ampholines pH 3,5 - 10.1.7. Prenosive tampon za gel Prvi pravac - belkovyybufer (.. Vidi poglavlje 2.2) Rješenje 1.1- motorima od 1.2- 1.6- 1.7 čuvati na 4 stupnjeva. CON 2 - 3 nedelje. Drugi koriste svezheprigotovlennymi.Prigotovlenie 20 ml polimerizacije smjesa potrebno dlyazapolneniya cijevi 12, vrši miješanjem 12 g uree, 6,75ml destilirane vode, 3 ml 1,1 ml 2,25 rastvoraTritona X-100 (20%). Ova mješavina je tretirana sa jonoizmenjivačke smoloyamberlit MB-1, je filtriran van i da ga je upisan 225 .mu.l amfolinovpH 3,5-10 i 900 .mu.l ampholines pH 5 - 7. mješavina je degazaciju, prije sipanja u aneposredstvenno cijev u koju je dodan 22,5 i 32,5 mklTEMED l 10 posto rješenje PSA.Polimerizatsionnuyu mješavina je uveden u cijev iz štrcaljke, zapolnyayatrubki odozdo prema gore na isti nivo 2 - 3 cm ispod verhnegokraya (gel visina stupca 11 cm). Top zatvaranje vodu.Posle slojevite gel polimerizacijom vode nad poverhnostyuudalyayut cijev i staviti u komoru gelelektroforeticheskuyu"Bio-Rad"Model 175 (SAD). U donjem domu nalivayutrastvor katoda rezervoar tampon. Uzorci cijev da se analiziraju se primjenjuje vobeme 50 - 150 .mu.l (100 .mu.g proteina). Polu variantefraktsionirovaniya primijeniti zapremine uzorka se povećava na 250 - 350mkl. Iz navedenog, ivica cijevi su slojeviti zaštitne rješenje 1.7 iverhnyuyu uređaj anodnog komora je ispunjena u ravnotežu buferom.Izoelektrofokusirovanie prinapryazhenii obavlja počevši od 400 V do 200 V.ch, a potom i na napryazhenii1000 V do 5400 V.ch suma vrijednosti, ili (noć režim) u 210 prinapryazhenii dvadeset sati, a zatim jedan sat 1000 zhesummarnogoznacheniya5400V.ch.Neravnovesnyyvariantizoelektrofokusirovaniya u svrhu pri naponu u rasponu od 400 V.ch SAR 200, a potom i na 1000V V.ch na ukupno znacheniya1000 - 2500 V.ch .po kraj izoel gel koloni ktrofokusirovaniya natopljen B5 prenosive ml pufera (rastvor 1.7) 10 min. kada komnatnoytemperature. Onda se gelovi nisu namijenjene za nemedlennogofraktsionirovaniya u drugom pravcu ihranyat brzo zamrznuti na -20 stupnjeva. C do nekoliko nedel.Dlya drugi frakcioniranje napravleniiispolzuyutmodifitsirovanny Laemmli metoda [130] u pločama s nagibom PAAG7,5 - 25% u SDS.Dlya prisustvu tu svrhu, sljedeća rješenja su pripremljeni, od kojih zatemsostavlyayut polimerizacije smjesa za formiranje ploča PAGE: 2.1. 60 posto akrilamid, 0,8 protsentnyymetilenbisakrilamid.2.2. Za odvajanje gel buffer: 1 M Tris-HCl (pH 8,8) .2.3. Buffer za slaganje gel: 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) .2.4. 10 posto dodecil natriya.2.5. 10 posto persulfate ammoniya.2.6. Elektroda elektroforeza tampon: 0.025 M Tris, glicin 0,192M, 0,1 posto SDS (pH 8,3) .2.7. Agaroznom gelu: 1% agaroznom rješenje s dobavleniem0,125 2,6% bromfenol plavo. Nakon kuvanja rastvorneobhodimo kuhano za 5 min., A prije kazhdymispolzovaniem gel mora rastopit.Rastvor 2,5 pripremljeni neposredno prije upotrebe, a ostatak je čuvati na 4 stupnjeva. Drugi pravac C.Fraktsionirovanie koje vplastinah veličini stranice 160 x 160 x 1 mm sa linearnim akrilamid gradientomkontsentratsii 7,5-25%, u uređaju za vertikalnogoelektroforeza. Gel ploče pripremljen u standardnim steklyannyhkassetah. PRIMJER detaljno korištenje etogooborudovaniya objavljen ranije [131] Konvencionalno, za formiranje paralelnih ploča 6 gel koncentracija sgradientom akrilamid (odvajanje gel) 2 A rješenje je pripremljen: svjetlo (AA koncentracija 7,5%) i teške (AA25% koncentracije), 100 ml svaki . Puna struktura ovih rješenja dat vtablitse.TablitsaSOSTAVY odvojen i koncentriran GELOVI + ----- + ------------------------------- ----------- + --------------- + | Komponente | odvajanje gela | Koncentriranje || + -------- + ------- + gel || | 25% | 6,5% | | + ------------------------------- + -------- + ------- + --------------- + | IBA-AA 60-0,8% ml | 41.8 | 12.5 | 3,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 1 M t0rIS pH 8,8, ml | 36 | 36 | - | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 0,5 M t0rIS pH 6,8, mL | - | - | 12,7 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 10% SDS, mL | 1 | 1 | 0,5 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | H2O, ml | 20.4 | 49.3 | 33,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | TEMED, l | 53 | 53 | 20 | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 10% PSA, l | 240 | 240 | 400 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + teški i jednostavna rješenja su mešati smesitelGradient bivši model 395 ("Bio-Rad", SAD) ili analogichnoeotechestvennoe opreme, tako da se dobije lineynyygradient koncentracije akrilamida u kasete koje postepennozapolnyayutsya pomoću peristaltičke pumpe. Tipično, istovremeno ispunjena ploča 6, koja osigurava visoku reproduktivnost identichnostihizgotovleniyai poluchennyhrezultatov. Nakon popunjavanja polimerizacije smesnaslaivayut vode. Polimerizacija se nastavlja za 30 - 40 min. Zatemvodu ukloniti, površine gela su izbrisani sa filter papirom izalivayut rješenje formiranje slaganje gel.Dlya pripremu 50 ml otopine koncentriše gelyaneobhodimo spoj komponenti prikazano u tabeli prichemkatalizatory (TEMED i PSA) je dodan direktno peredzalivkoy gel. Polimerizacija je završen u roku od 30 - 40 min.Udaliv vode na površini od slaganja gela nakladyvayutgel Prvi pravac i sipa rastopljeni agaroznom gelu (rastvor 2.7). Od ruba svake ploče je formiran "džep" dlyananeseniya proteina - markera. U roku od 5 min. agaroznom gelzatverdevaet, osiguravajući puni kontakt prvog gela napravleniyas gel ploča, i postavljen na kasetu dlyaelektroforeza.Elektroforez uređaja se vrši na sljedeći način rada: amperaže 30 mA po 200 Vmaksimalnaya plastinumaksimalnoe napona 50 Vt.Elektroforez prekinuta kada je vodeći rub boje dohoditdo niže odvaja gel .Nakon završetka frakcioniranje za detekciju proteina nagelevyh tablice pomoću bojenja sa Coomassie R-250 i azota -kislym serebrom.Okrashivanie proteina sa Coomassie R-250 N oestriasis metoduFairbanks prema [132] u otopini od 10 posto octene kiseline, 25 posto izopropanol, 0,05 posto Coomassie R-250.Okrashivanie obavljaju u vodenom kupatilu za 15 min. sposleduyuschey pranje nevezani boje 10 protsentnoyuksusnoy kislotoy.Okrasku azot - srebro se odvija u kiselom Blum modifikacija [133] pomoću sljedeće reagense: A rastvora natrijum hyposulfite (Na2S2O3 x 5H2O) - 0,2 g / l-rješenje azota - kiselina srebro 200 ml - 0,4 g srebra -kislogo azota, 150 l formalin razvija rješenje 200 ml: Na2CO3 - 8 g, 4 ml natrij rastvoragiposulfita, 100 .mu.l formalina.Vse Silvering procese kada se vrši na shaker i vplastikovyh kontejnera. Gela nakon bojenja sa Coomassie R-250otmyvayut slikam 10 posto octene kiseline u svetlogofona. Zatim tri puta 20 min. inkubirani u 25-protsentnomizopropanole gel za uklanjanje SDS-a, nakon čega promyvayutdistillirovannoy voda (20 sec.). Nadalje, za 1 min. gelinkubiruyut u hyposulfite rješenje i dva puta za 20 sekundi. otmyvayutv destilirane vode. U sledećem koraku gel čuva vrastvore azot -. Kiselo srebro 15 min, a zatim tri puta sa 20sec. isprana sa destiliranom vodoy.Na završnoj fazi gela je stavljen u otopini u razvoju iokrashivanie zaustavila pranje vodom, gel kogdana više pojavljuju novi pyatna.Fotografirovanie gelovi sprovedena u vlažnom državi naplenku visoke osjetljivosti (npr Mikrat 300). Gelovi dlyahraneniya osuši. Za tu svrhu, oni su bili dehidrirani u rastvor koji sadrži 3% glicerola i 50% etanola u trajanju od 30 min., Zatemplotno fiksna između dva sloja celofana i suši na sobnoj vnatyanutom temperature.5.5.3. Određivanje proizvoda izražavanja uključene vstavkimetodom immunoblottinga.Dlya provedeniyaimmunoblottinganeobhodimoraspolagatsootvetstvuyuschimi mišje antitijela protiv proteina kodiran vstavkoypolipeptida.Dlya rad otkrivanje proizvoda vstavkirekomenduetsya upotrebu konjugirana anti-miš imunoglobulina"Sigma" na razvodnjavanje 1: 1500 ili konjugirano protiv immunoglobulinovmyshi "Amersham" razrijeđen 1: 600.Na prva faza analize provedene electrotransfer proteina iz PAAGna nitroceluloza filter firma "Schleicher i Schull"(Njemačka) prema načinu Towbin [135] pomoću bufernogorastvora se sastoji od 20 mm Tris, 0.192 M glicin, 20 protsentnyymetanol, 0,1% SDS-a (pH 8,3 - 8,4). Elektromigracija se provodi za vertikalno komore B posebnu kompaniju electroblotting"Biorad" (USA) (ili druge slične opreme) privelichine napon 15. - 16. V i struja 120-160 mA techenienochi (12 - 14 časova) .Nakon okonchaniyaelektroperenosa nitroceluloza filtrpromyvayut u tri promjene 0,01 M PBS (natrijum - fosfatni pufer, pH7 4) 5 za otkrivanje min.Dlya prebačen u membranskog filtera proteina u techenie5 - 10 min. inkubirani u rastvor boje (0,25% Ponso-c, 40% octena kiselina, 15% metanol). Pozadina mrlje oprati 0,01MPBS.Na završnoj fazi prije vezivanja monoklonalnyhantitel, filter je ispran u 0,1M PBS, koji sadrži 30% izopropanola (za uklanjanje SDS), 3 x 20 min., Zatim pet puta u 0,01 M 0,01MPBS i PBS-0,05% Tween-20. Sorbtsiyuantitel suzbiti moguće nespecifični filter od inkubacije u rastvoru od 1% BSA u 0,01MPBS za 1 sat na 37 stupnjeva. C (ili preko noći na 4 grad.C). Filter je ispran sa 0,01 M PBS pet puta, a zatim 0,1 M PBS-0,05% Tween 20 pet puta. Na kraju, to se održava u inkubacije rastvoresootvetstvuyuschih antitijela u 0,1 M PBS (razrjeđivanje odabrana vkazhdom slučaj). Sljedeći inkubacije sa mAt 0,1MPBS filter je ispran 5 puta i 5 puta 0,1 PBS-0,05% Tween-20 i inkubira sa peroksidaznymkonyugatom protiv miša Ig G za 2 sata na 37 stupnjeva. C. Nakon pyatikratnyhpromyvok 0,1 M PBS-a i 0,1 M PBS-Tween-20 tampon dlyaokrashivaniya pour filter (12 mg 4-klor-1-naftol je raspušten u 4 ml etanola, volumen je podešen na 20 ml s 0,1 M PBS-a i dodao direktno peredprimeneniem 12 .mu.l od 30 posto hidrogen peroksid), sve dok jasno manifestacija ivyderzhivayut zon.5.5.4 obojenog. Otsenkabiologicheskiheffektov proizvod (e) funkcioniranje vstavki.5.5.4.1. Semipreparative proteina dodjelu pripreme poslefraktsionirovaniya protein izvlači dvodimenzionalni elektroforezom.Dlya polucheniyaotdelnyh pročišćeni protein preparatovdvumernym summarnyebelkovyeekstrakty frakcionisani elektroforezom u standardnim uvjetima gore opisano. Onda detektsiyubelkovyh frakcije se odvija u uvjetima ne-lociranje rastvoromatsetata 4M kalijuma. Slično frakcije su izbacili 20-40, a prikupljeni komada gelevyhplastin gelovi prije izolacije je čuvati na-20 stupnjeva. Mogu C.Nekotorye proteina eluted difuzijom. U etihsluchayah dobiti komada gela koji sadrži protein istog naziva, je tlo i homogenizirani u dejonizovanom vodom, a zatim eluted chegobelok za 15-20 min. homogenata gelyavstryahivaniem na magnetskoj mješalici. Nakon centrifugiranja vtechenie 20 min. na 700 g, supernatant je sakupljen i sosadkom Postupak se ponavlja još dva puta. Kombinovani supernatant (obemokolo 50 ml) je liofilizirano, taloga je redissolved u 1-2 mldeionizovannoy hladnu vodu i proizvode olakšanje od natrijum izbytkadodetsilsulfata. Otdelyayuttsentrifugirovaniem talog (15 min. U 3000 g), koji obespechivaetponizhenie koncentracija SDS-a u supernatant do 0,25% [134]. Onda otostatka soli i SDS-a raspolaže dijalizu protiv distillirovannoyvody za 12 sati na 4 stupnjeva. poluchayutelektroelyutsiey.Elektroelyutsiyu proteini C.Neelyuiruyuschiesya direktno obavlja u jedinici za firme "Bio-Rad" (SAD) ilianalogichnom opreme. Prilikom prve upotrebe dializnoymembrany (isporučen sa instrumentom) je inkubiryut vtechenie 30 min. u elektroda pufer za elektroforezu (rastvor2.6) na temperaturi od 60 stepeni. C. Fragmenti gel soderzhaschieiskomuyu frakcija staviti u staklenu epruvetu povezan sdializnoy membrana i ispunjen sa elektrodom tampon dlyaelektroforeza. Cijev je montiran u uređaju, gornji i sipao nizhnyuyukameru elektroforezu tampon, iprotsess povezanih elektrode obavlja preko noći na konstantnoj amperaže izrascheta 5 mA po cijevi i ograničenje napona. Belokkontsentriruetsya u volumen od oko 400 .mu.l buffer rastvorsobirayut ovo, membrana je ispran, i to rješenje se dodaje dio kosnovnoy. Rješenje protein je kasnije dijalizu proteina metodom Bradford izmeryayutkontsentratsiyu i liofiliziruyut.V rad odrediti razlichnyhrastvorah koncentracija proteina pomoću Bradford metodom [136]. Osnovu metodalezhit vezivanje boje Coomassie sjajan plave G-250 sbelkom analizaotbirayut rastvore.Dlya uzoraka (razrijeđen u sluchaeneobhodimosti) koja sadrži 1 - 10 od g proteina u 0,1 ml. Do 25 mklobraztsa dodao 25 ​​l rastvora boje koje sadrže 0,05% Coomassie brilliant blue G-250, 5% etanola, 10% ortofosfornoykisloty i apsorpcije na 594 nm. koncentracija Belkaopredelyayut iz krivulje kalibracije izgrađene rastvorabychego serum albumin ("Serva".5.5.4.2). Testiranje biološka svojstva staničnoj kulturi umetaka produktafunktsionirovaniya cheloveka.Dlya provjeriti biološka svojstva funktsionirovaniyavstavki proizvoda koji se koristi test - sistemi bazirani na kulturama humanih fibroblasta postnatalnyhdiploidnyh dobiti kao što je prethodno opisano [137] .Kultivirovanie ćelija obavlja se u DMEM medij (proizveden od "PanEco", RF) dopunjen s 5% seruma veliki rogatogoskota i 5% ljudske pupčane seruma krvi pupčane vrpce (proizveden od "PanEco"Rusija), koristeći ili staklenih bočica Carrel, ili plastikovyeodnorazovye firma madraci "Costar" (Nizozemska) ili u 96-lunochnyeplanshety firma "nunc" (Danska). Kao organski krasiteleyprimenyayut vitalne boje, metilen plavo [138] i krasitelGimza [139] (firma "Merck"Njemačka) .Na prvoj fazi je postavljen u zavisnosti kolichestvomkletok između rupe i intenzitet bojenja sa metilen plavo, dlyachego ćelije su zasejan na različitim denzitetima 96-planshetyi kulturan za 1 dan na 37 stupnjeva. C. Sljedeći kletkiprizhiznenno umrljana za 1 sat sa metilen plavo, dobro vkazhduyu dodajući 25 ul od rastvor boje. Onda nagriženo kletkidvazhdy isprati vodom i suši na zraku. Izmerenieopticheskoy rupa gustoća materijala koje nose electrophotometer"EFOS 9305" (firma "EFOS", Rusija) na 594 nm. Rezultati opredeleniyaopticheskoy gustoća i količina kulture po dobro kletokobrabatyvayut od strane kompjuterskog programa "Sigmaplot" ilianalogichnyh kompjuter programm.Pri proučava učinak operacije umetanja proizvoda naproliferativnuyu sposobnost ljudskih fibroblasta do ćelija raste u 96-ploče, dodati su različite kolichestvapreparata proteina i nakon 4 dana kulture probyokrashivayut metilen plavo kao što je gore opisano. Paralelno vseproby mikroskopiruyut (MBI-3 LOMO adaptirovannyykakinvertirovanny mikroskopom pomoću posebnog mlaznica) dlyaotsenki morfološkog stanja raste kletok.Pered Giemsa bojenje raznoyplotnosti ćelijske suspenzije u DMEM medij s 10% fetalnog telećeg seruma vobeme 200 l dodan u bunarima od 96-te ploče. Tako pervyyvertikalny broj rupa je pod kontrolom, nije zapolnyayutkletochnoy suspenzija. Tablice su inkubirani u atmosferi od 5 protsentnogouglekislogo gasa na temperaturi od 37 stupnjeva. C. Nakon jednog dana kletkifiksiruyut dodajući da svaki i 50 .mu.l holodnogosvezheprigotovlennogo 2,5 posto glutaraldehid. Cherez30 minuta. učvršćivanje na 4 stupnjeva. C je uklonjen iz bunara držač, lunkidvazhdy oprati hladnom Hank-ovo rješenje i Giemsa mklkrasitelya ispunite 100, specifičnog vezivanja sa hromatinom razrijediti 1:50 prije upotrebe. Kletkiinkubiruyut boja 3 sata na 37 stupnjeva. Krasiteludalyayut C. Zatim, bunari su dva puta isprana sa Hanks rješenje, ispunjen 100mkl otpušta rješenje (0,1 M NaH2PO4: C2H5OH - 1: 1) iinkubiruyut na sobnoj temperaturi 15 minuta. kada nepreryvnomperemeshivanii. Mjerenje apsorpcije otpušta u fotometar rastvoraprovodyat "EFOS 9305" na talasnoj dužini od 620 nm.6. Evaluacija prehrambenih proizvoda, poluchennoyiz genetski modificiranih izvora funkcionalne - tehnoloških svoystvam6.1. Potrebe za bilo kakvim istraživanje porazdelu 6 određuje stručnjak u Moskvi gosudarstvennogouniversiteta Applied biotehnologiju Ministarstva prosvjete ruski general iprofessionalnogo Federatsii.6.2. Život proteina ljudskog organizmaglavenstvuyuschuyu igra ulogu, pa se čini vazhnymprosledit, ako se ne podvrgne bilo kakve promjene u protsessegeneticheskoy modifikacijama kao mozhetprivesti genetskog inženjeringa za promjenu strukture i funkcije proteina, proteina chastnostifermentov.Svoystva jedinstveno vezan za svoju strukturu. Osnovnymmetodomissledovaniyastrukturybelkayavlyaetsyametodrentgenostrukturnogoanaliza svoje kristale. Međutim, za većinu proteina se koristi u nutritivnih podatke o svojim strukturepo nekoliko nepoznatih razloga. S druge strane, poznato je chtostruktura proteina određuje njihova termodinamička svojstva, što utiče na njihovu funkcionalnu svoystva.Suschestvuet broj metoda termodinamička svojstva mjerenja, među kojima je preferirana metoda je kalorimetrije. Etotmetod vam omogućava da mjerenje ovisnost temperature teploemkosti.Iz ​​dobiti ovisnosti može izračunati dlyanativnoy toplotni kapacitet i denaturirani oblici proteina, a proteini temperaturudenaturatsii entalpija. Izračunate termodinamičkih parametrypozvolyayut definirati sastavni hidrofobnosti i konformatsionnuyustabilnost proteina [38-40]. Ove karakteristike tesnosvyazany sa glavnim funkcionalnim svojstvima [41-44] .Metod ion-uparivanje HPLC vobraschennyh faze omogućuje identifikaciju jedinice zamenyaminokislotnyh ostataka u proteinu makromolekule i neophodan prisravnitelnom studija proteina [44] .U procesu promjene genoma organizma njemu nakaplivayutsyakomponenty, obespechivayuschieegoustoychivost na faktore vneshnimneblagopriyatnym - bolesti, insekti - štetočina herbicid, itd U određenim koncentracijama, te komponentymogut biti opasni za ljudsko zdravlje, koristi se u pischuprodukty proizvedeni pomoću genetičke metode inzhenerii.Poetomu tijekom industrijske prerade sirovina kao što mogutpotrebovatsya promjene postojeće tehnologije, obespechivayuschieminimalnoe rezidualni opasnyhdlyazdorovyakomponentov. Takve promjene u tehnologiji može uticati nakachestvennyh indikatora (funkcionalno -tehnologicheskihsvoystvah) proteina pripreme proizvedenog iz tog geneticheskimodifitsirovannogosyrya.Krome, predpolagaetsyatselenapravlennoe promijeniti sastav aminokiselina proteina izvađen iz genetski modificiranih prehrambenih proizvoda (npr imaju uravnotežen ACN) za poboljšanje njihove pischevoytsennosti. To će neminovno podrazumijeva promjene u funkcionalnim svojstvima komercijalnih tehnoloških proteina pripreme iotrazitsya kvalitetu prehrambenih proizvoda, u kojem oniispolzuyutsya. To je, pak, može dovesti do promjena u neobhodimostivneseniya procese koji koriste etipreparaty. Stoga, kontinuiranu kontrolu (monitoring) svojstva proteina preparata proizvedenih iz hrane sirovina kada geneticheskimodifitsirovannogo sigurno bezopasnomsoderzhanii komponente štetnih cheloveka.Mikro- proteina i makro-molekula određuje ryadnaibolee važna funkcionalna svojstva proteina, kao kakrastvorimost, sposobnost da se stabilizira emulzije i pjene oblik gelovi zadržati masnoće i vlage [9-13] .Ovih funkcionalna svojstva su u direktnoj vezi skharakteristikami gotovih prehrambenih proizvoda. + ----------------------- + ------------------------- --------------- + | funkcionalna svojstva | Učinak na svojstva gotovog || | Proizvoda | + ----------------------- + ----------------------- ----------------- + | pH vodene suspenzije | karakteristika proteina preparatov- || | Definira osnovnih mogućnost || | Upotreba proteina droga u || | Posebnu vrstu proizvoda | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | Rastvorljivo | se koristi kao primarni pokaza- || | Tell-kvalitetnih proteina preparatov- || | Izaziva reološka svojstva || | Sadrže proteine ​​sistema hrane, održivog || | Ness emulzije stabiliziran sa Belgorod || | Com zhirouderzhivayuschuyu sposobnost belko- || | O pripremama | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + | reološka svojstva | odrediti nivo administracije droge || vodena disperzija | proizvod koji pruža tražene || | Kompleks reološka svojstva gotovog || | Proizvoda utiče na guna materijalne || | Prenosi u procesu | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | zadržavanje vode i | utiču na nivo uvođenja proizvoda || zhirouderzhivayuschaya | proteina pripreme pružanje || kapaciteta | smanjenje gubitaka u procesu || | Obrađeni (kuhana i pržena), uniforme || | Konzistentnost proizvoda, što je smanjenje u braku || | Rezultat odvajanje vode i masti, || | Smanjenje Volume proizvodi | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | kritična koncentracija | određuje nivo uvođenja proizvoda || cija gela | proteina pripreme pružanje || | Potrebna kompleks strukturnih - mehanički || | ICal svojstva gotovog proizvoda | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | emulzija | određuje nivo uvođenja stabilnosti proizvoda || | proteina pripreme pružanje || | Priprema stabilnih masne emulzije, || | Sprečava odvajanje masti u procesu || | Processing | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + trenutno ne postoji standardizirani metodyopredeleniya funkcionalna svojstva i rezultata mjerenja dolzhnynosit komparativne prirode u odnosu na droge ilikommercheskim proizvode iz nemodifitsirovannogopischevogo syrya.Osnovnye metoda za određivanje funkcionalne preparatovprivedeny svojstva u sljedećoj tablici. -------------------------- + ---------------- + -------- + ------------ + | index | Metoda za određivanje | književnih || || izvor | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | 1 | 2 | 3 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | sastav Identifikacija | histoloških metoda | 51 || proizvoda ||| + ----------------- --------- + ------------------------ + ------------ + | Rastvorljivo | spektrofotometar | 50 | + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | zadržavanje vode | metodom centrifugiranja | 46 || sposobnost ||| + --------------- ----------- + ------------ + ------------------------ + | stabilnost emulzije | metodom centrifugiranja | 47 | + -------------------------- + ------------- ----------- + ------------ + | kritična koncentracija | thermotropic način | 48 || gel | gel + --------- || ----------------- ------- + ------------------------ + ----- + | Zhirouderzhivayuschaya FPIC b- | metoda centrifugiranje | 49 || Nosta ||| + -------------------------- + --------- --------------- + ------------ + | konformacione | microcalorimetry | 38-40 || stabilnost ||| + ------ -------------------- + ------------------------ + ---- -------- + | Identifikacija amino | ion-uparivanje HPLC metoda | 45 || ostataka ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | Termodinamička svojstva | metoda diferencijal | 39 || | Skeniranje microcalorimeters ||| | Kalorimetar || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Integral hidrofobnosti | microcalorimetry | 40, 41, 42, || || 43 44 | + -------------------------- + ---------------- -------- + ------------ + | reološka svojstva | viskozimetrije | 52 || vodena disperzija ||| + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | sastav aminokiselina | HPLC | 45 | + -------------------------- + ------------ ------------ + ------------ + | organoleptičkih svojstava | Qualimetry | 53 || masti: boja, mirisa, transparentnost |||| ||| + + -------------------------- ----------------------- - + ------------ + | indeks prelamanja | Refraktometrija | 53 | + -------------------------- + ------------------------ + ------------ + | debeo Težina | Denzitometrija, | 53 || | Gravimetrija || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | viskoznosti masti | viskozimetrije | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | masnih - kiselina sastav | GC | 53 | + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Jod broj | volumetrije | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | kiselina value | volumetrije | 53 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | broj saponifikacije | volumetrije | 53 | + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | želatinizaciju temperatura | viskozimetrije | 54 | | škrob ||| + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | veličina škroba žitarica | Optička mikroskopija | 54 | + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | zadržavanje vode | Gravity | 54 || sposobnost škrob ||| + -------------------------- + ------- ----------------- + ------------ + | reološka svojstva | viskozimetrije | 54 || vodeni škrob disperzije ||| + --- ----------------------- ------------------------ + + - ----------- + | Oticanje škrob | Optička mikroskopija | 54 || zrna ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | Kritična koncentracija | metoda thermotropic | 54 || želiranja škrob | želiranje || + -------------------------- + -------------- ---------- + ------------ + | sadržaj amiloze i | spektrofotometar | 54 || amilopektina ||| + ----------- --------------- + ------------------------ + ------------ + 7. mene 
Udio u društvenim mrežama: 

 
Povezani
 
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.