Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.

UtverzhdenyGlavnym gosudarstvennymsanitarnym vrachomRossiyskoy Rusija -Prvi zamestitelemMinistra zdravoohraneniyaRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO9 Jan 1998 godaData uvod - 8 Jun 1998 goda4.2. Metodi kontrole. Biološki Mikrobiološki Dijagnoza difterije FAKTORYLABORATORNAYA INFEKTSIIMETODICHESKIE UKAZANIYAMU 4.2.698-981. Savezna službenici dizajniran reference - laboratoriidiagnostiki difterije infektsiiMoskovskogonauchno Institut za epidemiologiju i mikrobiologiju im.G.N. Gabrichevskogo (MD Mazurova IK, MD Melnikov k.b.n. Kombarova S., O. Borisova) i DepartamentomGossanepidnadzora ruskog Ministarstva zdravlja (Žilina NY .2). Odobreni i stupiti na snagu glavni gosudarstvennymsanitarnym doktor Federacije, prva zamestitelemMinistra zdravlje Rusija od April 8, 1998 D.3. VvedenyvzamenMetodicheskihukazaniy4.2.589-96"Laboratorijska dijagnostika difterije infekcije".1. smjernice području primeneniyaMetodicheskie sačinjen da pomogne spetsialistambakteriologicheskih sanitarne laboratorije - epidemiologichoskoysluzhby, zdravstvene - ustanovama i naučnih istraživanja Instituta za poboljšanje laboratornoydiagnostiki difterije infektsii.2. Karakteristike uzročnika difterije infektsiiVozbuditelem difteriynoyinfektsiiyavlyayutsya toksigennyeCorynebacterium difterije. Nontoxigenic Corynebacterium difterije difteriine uzrok infekcije. "etiološki" etihmikroorganizmov značaj kada zaraznih bolesti (faringitis, artritis, endokarditis, itd) zahtijevaju posebnu dokaz. Kada vydeleniinetoksigennyh sojeva C. diphtheriae od bolesnika sa sumnjom na infekciju nadifteriynuyu treba obratiti pažnju na pravilnostprovedeniya bakteriološko ispitivanje i vrednovanje temelji na sposobnosti toksigennyhsvoystv.V C. diphtheriae proizvode ekzotoksinlezhit fenomen faga (ili lizogene) konverzije. Konversiyanetoksigennyh sojeva C. diphtheriae u naoborotvosproizvoditsya toksigenih i samo u određenim, eksperimentalnim uslovima. U tehsluchayah kada tokom početnog sadnog materijala izolovane toksigenih otbolnyh difterije, a na povtornyhobsledovaniyah nakon terapije antibioticima - netoksigennyekorinebakterii difterije, može se pretpostaviti da kada ispolzovaniiantibiotikov prvenstveno nestati toksigenih sojeva kakbolee osjetljivi na njihovo djelovanje, i nontoxigenic shtammyprodolzhayut dodijeljen. Ista situacija se može kreirati i prisanatsii antibiotike operateri i istovremeno vydelyayuschihtoksigennye nontoxigenic Corynebacterium difterije. Detekcija Utaka mediji u ponovljenim istraživanjima netoksigennyhshtammov ne može tumačiti samo kao gubitak sposobnosti shtammovprodutsirovat ekzotoksin.Taksonomicheski bliski pogled C. diphtheriae su C.ulceransi C.pseudotuberculosis (C.ovis). Ovi mikroorganizmi - prirodnyepatogeny krupne i sitne stoke, konja. Otmechenasposobnost ove vrste bakterija proizvede toksin podobnyydifteriynomu. Tu su i "nontoxigenic" sojeva. Izvestnysluchai dodjelu "toksigenih" C.ulcerans u kliničkoj kartinezabolevaniya slično difteriey.Na orofaringealne sluznicu nosa i normalnog chastovstrechaetsyalozhnodifteriynayapalochka Hoffmann (C.pseudodiphtheriticum). Mogućnost da se izoluju i identifitsirovatdannye bakterije služi kao kriterij u procjeni kvalitete rabotybakteriologov interepidemic period.Vse mikroorganizama iz roda Corynebacterium yavlyayutsyagrampolozhitelnymi štapići, ne formiraju spore obladayuschimirazlichnoy stupanj polimorfizma. Većina vrsta raste bolje vaerobnyh usloviyah.Obychno kolonije mikroorganizama iz roda Corynebacterium naplotnyh hranjivoj podlozi (npr na krvni agar) imeyutserovato - bijele ili žućkaste, neprozirna ilipoluprozrachnye, okruglog oblika, promjera 1 - 3 mm. Najčešće onibyvayut nježnim dosljednost, iako neke vrste rodakorinebakteriimogutobrazovyvat grubo R-kolonii.Predstaviteli ove vrste nemaju visok fermentativnoyaktivnostyu. C.diphtheriae raste 37sh C, otporan na nizkoytemperature osjetljivi na visokom nivou. Svi dezinfekciju veschestvav konvencionalne koncentracije (3 - 5%) korinebakteriidifterii uništen u roku od 20 - 30 minuta. Toksigenih C.diphtheriae boleechuvstvitelny na antibiotike nego nontoxigenic. Vozmozhnopoyavlenie antibiotik-rezistentnih sojeva. Široko opredelyatchuvstvitelnostkantibiotikam izoluje otbakterionositeley ne bi trebao biti zbog neusklađenosti rezultatovlaboratornoy uzorka na akciju antibiotika na tijelu vozbuditelyadifterii cheloveka.Dlya C.diphtheriae karakterizira značajan polimorfizam -raznoobrazie veličine i oblika ćelije. Ćelije imaju oblik klubova, reketi, itd estrusa ćelija interpozicije podsjeća rimskietsifry X, V. Kada boja se često nalaze vyrazhennayavnutrikletochnaya striation, zbog zerenvolyutina prisustvo. Opisao afinitet volutin u metilen plavo i one priobrabotke boje granulama ili trake (klastera granula) mrlja plave boje, au nekim protoplazme sluchayahmozhet steknu rozovyyottenok.Ispolzovanievbakteriologicheskoy okraskipoGramuyavlyaetsyanetselesoobraznym praksi, ili čak poskolkukletkiC.diphtheriaelegkoobestsvechivayutsya spirtomimogutvyglyadetvmazkegramvariabelnymi gramotritsatelnymi.Dlya C.ulcerans i C .pseudodiphtheriticum sklonnostk odlikuju paralelni raspored ćelija. 24 - 48 h kulture etihvidov često ovalnom obliku kletok.Po obliku kolonija i neke biohemijske svoystvamC.diphtheriae podijeljena u kulturno - biohimicheskievarianty - gravis, mitis, intermedius.Cherez 48-72 sati mitis rasta varijanta predstavlja tip koloniiS - glatka, promjera od 1 - 2mm-varijanta SR-gravisobychno konveksnim kolonije sa podignutim centar s promjerom od od 2 - 3 kolonije mm utjelovljenje intermedius - s-tipa, mala, ravna, glatka, sravnjena sa zemljom promjera ruba 0,5-1 mm. Sljedeće opisuje samo dvakulturalno - biohemijski utjelovljenje - gravis i mitis, tako kakbiovar intermedius rijetke i biokemijske svoystvamne razlikuje od biovara mitis.Na krvi telluritovyh medija nakon 48 sati rasta koloniiC.diphtheriae utjelovljenje gravis, kao i kolonija C.ulcerans, crna, mat imaju radijalne brazde. KoloniiC.pseudodiphtheriticum imaju karakterističan svjetlo obodok.V bakteriologicheskoypraktikeopiratsyatolko namorfologicheskie svojstva kolonije ili mikroba ćelija priidentifikatsii C.diphtheriae, nije moguće. Opisanysluchai bakteriološki hipo- i hyperdiagnostics (55% i 14,5%, respektivno) kada se koristi uchettolkomorfologicheskih znakova. Pri identifikaciji C.diphtheriaeneobhodimo upotreba test kompleks prvenstveno patogenost (toxigenicity) glavni priznakavozbuditelya difterii.Opredelenie toksigenih osobine koje bakteriolozi prvi dan rasta sumnjivih kolonija na pločama pervichnogoposeva materijala. Da biste izbjegli greške u određivanju toksigennyhsvoystv coryneform bakterije, potrebno je proučiti ovu indikaciju umaksimalnogo broj kolonija iz tablice primarnog poseva.Pri tehnike skladu je opisano u nastavku može proučavati toksigennostbolee od 20 sumnjivih kolonija iz jedne analize. Nelzyaizuchat materijala na množinu rast sumnjivo koloniytolko 1-2 blyashkah.Fermentativnaya aktivnost mikroorganizama studirao putemopredeleniya tsistinazy enzima ureaze, sposobnost da se prionuti dokisloty glukozu, saharozu, škrob. U rijetkim slučajevima, kogdaneobhodimo identificirati C.ulcerans, dodao navosstanovlenie nitrat test nitrity.Uchityvaya da kada difteriynoyinfektsii identifikacija patogena vodeći element je određivanje prisutnosti toksina otsenkidrugihsvoystvimeet pomoćnih znachenie.Ispolzovanie "dugačak" ugljenih hidrata je broj viška priidentifikatsiya C.diphtheriae.Prakticheskimbakteriologam bavi laboratorijske dijagnostike difterije, ne trebuetsyaprovodit identifikaciju vrste drugih mikroorganizama rodaCorynebacterium. U isto vrijeme, u laboratoriju, gdje izazvalo provoditsyadiagnostika bolesti "nedifteriynymi"Corynebacterium, nedovoljna upotreba čak "dugačak"ugljenih hidrata red. Za precizne podatke identifikaciju mikroorganizmovneobhodimo koristiti chemotaxonomic metode istraživanja, kao što detektuje prisustvo mycolic kiseline, ćelijskog zida bakterija i nekih vsostave drugie.Takim način mikroorganizam se bira vozbuditelemdifterii ako ima toksigenih svojstva opredelennymspektrom enzimsku aktivnost (dekolte glukoze, škrob, odsustvo saharoze razgradnje enzima tsistinazy prisutnost, odsutnost fermentaureazy) i karakteristične morfološke -kult uralnymi znakova (formiranje kolonija na crnoj ili serogotsveta krovyano - telluritovyh okruženja prilagođen, prineobhodimosti, morfologiju ćelije - polimorfne ne formiranje sporpalochki) .3. IssledovanieBakteriologicheskoe bakteriološki studije su sprovedene u laboratornoydiagnostiki difterija infekcije, identifikacije izvora zaraze za prevalencije toksigenih inablyudeniya korinebakteriidifterii.VZYaTIE I ISPORUKA MATERIALA1. Uspjeh bakteriološko ispitivanje u znachitelnoystepeni zavisi blagovremeno i tačno hvatanje materiala.2. Uzimajući materijal treba posebno obuchennyemeditsinskie zdravstvenih radnika - briga uchrezhdeniy.3. U studiji ispitati orofarinksa i difterije nos.Pri difterije rijetke lokalizacija (oka, uha, rana, kože, vagina) osim lezije treba uzeti materijal iz smindalin nosa.4. Uzimanje materijala vrši se pomoću sterilne briseve vatnyhsuhih. Za njihovu pripremu koristeći drveni ilimetallicheskie (od nehrđajućeg čelika) šipke, jedan od kontsovkotoryh čvrsto rana sloj vate (primerno120 mg vatom). Tamponi treba biti u obliku "kapi"i ne"vreteno". Tamponi su postavljene u epruveti s pluta ili vatnymiprobkami tako da na kraju tampon ne dodiruje dno i stenokprobirki. Sterilisati tamponi u toplom pećnica na topli zrak na temperature140sh C za jedan sat ili u autoklavu na 0,5 atm. 30 Min.5. Materijal iz orofarinksa i nazalni brisevi uzimaju pojedinačni prazan želudac ili ne ranije od dva sata nakon obroka, kada horoshemosveschenii, koristeći lopaticom bez dodirivanja bris jezika ivnutrennih površine obraza i zuba. Jedan bris sobirayutmaterial sa lezije orofarinksa - krajnika i prineobhodimosti - s lukovima mekog nepca, resica ili ždrijela zadneystenki. U prisustvu plaka, materijal treba uzeti sgranitsy oboljelih i zdravo tkivo, lagano pritiskom na nihtamponom. Za preuzimanje materijala iz nosa koristi drugi bris koji je prvo u jednom, a zatim uveo u drugom nozdrvu, nekasayas snaruzhi.6 nozdrve. Kada laringoskopijom materijal (sluz film) sobirayutneposredstvenno larinksa. Materijal sa lezijama kozhisleduet prikupiti suho bris nakon uklanjanja kore ili strupa.7. Tamponi imaju bytdostavleny u laboratoriyunepozdnee 3 sata nakon uzimanja materijala. Kada provedeniiobsledovaniya kontingente u udaljenim bakteriologicheskihlaboratory područjima, preporučuje se da se biljni materijal na kup spitatelnoy okolinu ili koristite transporta sredu.8. U slučaju transporta srednje materijal sobirayutsuhim bris umočen u epruveti sa okolinom i da osiguraju da utikač nije mokra bris. Imajte na umu da primenenietransportnoy okruženje proteže izdavanja konačnog otvetana jedan sutki.9. Kup (ili epruveti sa prijevozom srednje) sa posevomissleduemogo materijal može biti postavljen za odgoj vtermostat na 37sh C za 15 - 18 sati, nakon čega isporučiti vlaboratoriyu.10. Tokom transporta na velike udaljenosti kao tamponi mozhnoispolzovat presoaked rastvoromglitserina. Tampon impregniran sa 5 posto rješenje glicerina vdistillirovannoy vode odvodi na zidu posude sa rješenjem, poboljšati in vitro, kao i suho bris i sterilisati pri0,5 bankomat. 30 Min.11. sezona ispitnog materijala hladno se isporučuje u vrećama vbaklaboratoriyu - termosima, kako bi se spriječilo zamerzaniya.12. Vsluchaeneobhodimosti od Corynebacterium difterije u postmortalnyhissledovany materijala tselesoobraznobrat sa krajnika, grkljana, i nosne šupljine, kao u vnutrennihorganah redko.13 patogena otkrivena. Svaku epruvetu sa ispitnog materijala (grla, nosa ilidrugaya lokalizacija) je priključen na taj broj. Priloženi cijev spiskeukazyvaetsya broj, prezime, ime (ili inicijalima), starost, naziv institucije, vodič materijala ili kući adresobsleduemogo, svrha istraživanja (s dijagnostičkim ukazaniemdiagnoza, na osnovu epidemiološkim indikacijama, preventivna zaštita), datum uzimanja materiala.HOD istraživanja. PRVI DENPosev materiala.Material za istragu orofarinksa, nazalni ili drugihporazhennyh sjedišta odvojeno zasejana na površini guste hranljivih medija izrekomenduemyh, sipa u čaše Petri.Posev iz jednog lica za proizvodnju jednog kup koristeći prietom pola površini sjemena srednje izrotoglotki materijala, a drugi - za biljnu materijal iz nosa. Kada posevemateriala od kože ili drugih mjesta dodali još jedan kup. Nije dozvoljeno usjeva materijal od nekoliko pojedinaca po chashku.Pri sadnog materijala se utrljava u medij sa svih strana tampon nauchastke površine 2 x 1 sq. cm - formiranje takvih "igralište"To je imperativ. Zatim taj isti bris inokulisane ostavshuyusyapoverhnost 1/2 šolje. Sjetva proizvesti česte neperekryvayuschimisyashtrihami bez skidanja tampona od površine hranljive podloge i nepromjenjiv položaj tampon. Ova metoda omogućava zaseyatves sadnog materijala sa tampon dobiti izolovane kolonije (chistuyukulturu) za daljnju identifikaciju sjetve direktno na chashkepervichnogo koja skraćuje test odnisutki. Inokulisane ploče ili cijevi koje sadrže transport srednje pomeschayutv termostat na 37sh C. sijanje podloge za transport za proizvodnju nasleđivanja dan gusta srednje bris ostenki pritisne cijevi ili petlje, uzimajući materijal iz osadka.Posev treba obaviti na tablice sa srednjim, temperatura ili zagrejao prikomnatnoy u inkubatoru (15-20 minuta) .VTOROY day1. Kolonije uzgajaju na tablicama 24. do pregledanja chasaposle sadnog materijala (ako se materijal lima u drugom polovinednya, gledanje se obavlja u tačno 24 sata, i.e. i druga polovina dana), bilo vizualno ili pomoću stereoskopski mikroskopabinokulyarnogo (MBS) .2. Čaše sa kolonijama, kao što su difterija, uzeti dlyadalneyshey identificirati kulture u svim testovima. Mikroskopiipreparatov - brisevi "sumnjiv" Kolonije mogu biti neprovodne. "sumnjiv" kolonija krovyano - telluritovyhsredah nakon 24 sata svjetla rasta - sivi, konveksan, sravnjena sa zemljom rubovima, u 48 sati - sivi sa metalik nijanse, srovnymiili malo nazubljenih ivica, urušava priprikosnovenii petlje ili meke konzistencije. od "dubiozan"kolonije je spreman pripravaka - mazki.Kletki Corynebacterium difterije iz kulture uzgajaju na inhibitori sredahs rasta (kalijum tellurite, hinozol) mogu bytukorocheny, zadebljan, ali njihova inherentna lokacija i polimorfizmsohranyayutsya. Evaluacija morfoloških osobina ne pozvolyaetustanovit vrsta mikroorganizma, ali daetvozmozhnost trebalo da se to roda korinebakteriy.Esli mikroskopija show coli karakteristika rodakorinebaktery, ove kolonije su odabrane za dalneysheyidentifikatsii u svim testovima. U slučaju drugih formmikroorganizmov (koka, kvasac, spore šipke), te kolonije dalneysheeizuchenie prekraschaetsya.3. U slučaju rasta "sumnjiv" slične kolonije treba odmah nastaviti s proučavanjem njihove imovine toksigenih svoystv.Toksigennye studija ne manje od 2 izolirovannyhkolony sadnjom pola svakog od kolonije na srednjem dlyaopredeleniya toxigenicity i nepečene petlje, - u Pizi, srednje i drugu polovinu kolonije - u epruvetu beveled syvorotochnymagarom za očuvanje i akumulacije kulture. Kada nevozmozhnostisnyat 1/2 kolonije za sjetve na toxigenicity i srednje Pizuispolzuetsya materijala kolonii- čitav rod na agarisklyuchaetsya nagnuti i dalje, iz epruvete kulture koristi sproboy Pisa. S obzirom da je nakon 24 sata rasta veličine kolonije i materijalnih imeyutnebolshie 1/2 ili 1 kolonije mogu bytnedostatochno za akumulaciju difterije toksina u uzorku natoksigennost, te da u materijalu mogutnahoditsya istovremeno toksigenih i nontoxigenic raznovidnostikorinebaktery difterije, neophodno je da se ispita toksigennyesvoystva strane je to moguće, na maksimalan broj kolonija (više od 20), miješanje za 5. - 7., sličan onome koji blyashku.4 kolonije. Ako je nemoguće da probaju postavljanje toksigennostklassicheskim metoda (vidi. P. 3) zbog nedovoljnog velichinykolony, njihova studija, miješanje istog tipa kolonije neskolkihblyashkah. Ne gori kroz petlju, inokulisani u srijedu Pisa. Čaše spervichnym sjetve ispitnog materijala ponovo je stavljen vtermostat za 24 sata i ponovo ih trenutno (po tretisutki) 0,5. Ako samo jedna kolonija raste, može se sejati nasredu za utvrđivanje toxigenicity i bez paljenje petlje na stolbiksredy Pisa odrediti tsistinazy. Identifikatsiimozhno za daljnje korištenje cijevi kulture sa uzorkom ili sa Pisa blyashkicherez 48 sati rasta, ili 24 sata rasta na vyyavlennyhtoksigennyh kultury.6 svojstva. Kako bi se izda preliminarni odgovor na rast sluchaemnozhestvennogo sumnjive kolonije mogu proizvestiposev nekoliko kolonija u tečnom mediju dlyapostanovki Phragmites, Sachse napuniti dodatni uzorak (3 -5 slične kolonije držanje nakon 30 minuta inkubacije.) I Pisa uzorka (5-6 slične kolonije , što čini preko 3 sata inkubacije). Priharakternoy za Corynebacterium difterije u MBS morfologija kolonije, morfologiju ćelije od mikroskopije, Sachse negativan uzorak, uzorak pozitivnih rezultata Pisa, Phragmites može vydatpredvaritelny odgovor na otkrivanje kulture sumnjivih nakorinebakterii difterije nakon 48 sati (treći dan) sa sjetve momentapervichnogo istragom materiala.TRETY day1. Nakon 24 sati, kada je određeni liniypretsipitatsii na medij za određivanje toxigenicity, polozhitelnoyprobe na tsistinazu, proučavao kulturu identifikovani kakkorinebaktery toksigenih difterije i izlaza dokumentirovannyyotvet.Pri odsustvu posebnih Talog linija na srednjem dlyaopredeleniya toxigenicity, ploče su inkubirani za još 24 chasa.2. Kulture uzgajaju na agar kosim ili serum sproby Pisa (nakon evaluacije njegova čistoća) su zasejana u srednjim dlyaopredeleniya biohemijski utjelovljenje (saharoza, glukoza, škrob) ifermenta ureaze (urea hidrolize) .3. Ploče s osnovnim inokulacije issleduemogomaterialaprosmatrivayut vizualno ili ponovno MBS 36 -48 sati inkubacije u inkubatoru. U prisustvu "sumnjiv"Kolonije proučavaju aktivnost njihove toksigenih svojstva tsistinaznuyu ivydelyayut čista kultura na agar skoshennyysyvorotochny (cm. Druga studija dan, str. 3) .Ako ne kolonije sumnja korinebakteriidifterii, dati konačni odgovor koji Corynebacterium difteriine vyyavleny.Pri nema rasta na agar početnog sjetve cherez48 sati inkubacije, u nekim slučajevima zahtijeva ponovnog uzimanja iissledovanie materijala. Potpuno odsustvo rasta često vsegosvidetelstvuetonarusheniipravilbakteriologicheskogoobsledovaniya (uzimajući isporuke, sadni materijal i kultivirovaniyaissleduemogo) .CHETVERTY dan (ili peti) 1. Kada specifične Talog linije dlyaopredeleniya toxigenicity okruženje (24 sata inkubacije, uzorci natoksigennost 48 rast sat primarne sjetve) polozhitelnoyprobe dati tsistinazu dokumentirani prikazuje vydeleniitoksigennyh difterii.2 Corynebacteria. Kulture uzgajaju na agar kosim ili serum sproby Pisa, nakon utvrđivanja njegova čistoća, je inokulisati na srednjem dlyaizucheniya biokemijskih svojstava (Hiss medij s saharoza, glukoza, škrob, Sachse uzorak sa ureom ili bujon) .3. Ponovo (nakon 48 sati) uzeti u obzir rezultate uzorka natoksigennost pozirala u 2. dan studije. Odnovremennoproizvodyat saccharolytic čuvanje imovine i aktivnost ureaze vprobah postavljena na 3 dana issledovaniya.Pri odsustvu posebnih Talog linija 48 chasovposle staging uzorke toxigenicity ali polozhitelnyhrezultatah uzoraka za tsistinazu, glukoza, ureaza negativne rezultatahprob i saharoze, kulture identifikovani kakkorinebakterii difterije nontoxigenic, ukazuje biohimicheskogovarianta.Pri izolacija toksigenih Corynebacterium difteriidopolnitelno dati odgovor o biohemijski Propert tvah (ili96 72 sati nakon početnog sadnog materijala) .BAKTERIOLOGICHESKOE ZAKLYUCHENIE1. Prisustva specifičnih Talog linije sa opredeleniitoksigennyhsvoystv, pozitivan test za tsistinazu, negativan test za ureaze, kulturu ibiohimicheskie karakteristična svojstva (saharoza, glukoza, škrob) pozvolyayutzaklyuchit koji se odnosi na izolovana kultura korinebakteriydifterii um toksigenih, biohemijske ili mitis.2 utjelovljenje gravis. Odsustvu posebnih Talog linije sa opredeleniitoksigennyhsvoystv, pozitivan test za tsistinazu, negativan test za ureaze, kulturu ibiohimichekie karakteristična svojstva omogućavaju nam da zaključimo da izolovana kulturaotnositsya vrstama Corynebacterium difterije, nontoxigenic, biohemijske ili mitis.3 utjelovljenje gravis. U prisustvu Talog linije identične kontrolu spetsificheskimliniyam soj Corynebacterium difterije, polozhitelnyhprob ureaze, tsistinazu, glukoze i škroba fermentacije, nepostojanje saharoze fermentacije vnitrity nikakvo smanjenje nitrata, kultura pripada coryneform ultserans smeta toksigenih variant.Pri ne Talog linije pri određivanju toksigennyhsvoystv i imate sve ostale funkcije karakteristične dlyakorinebaktery ultserans, nontoxigenic opcija ibakteriologichesky odgovor smatra negativnim ym.4. Kada odaberete Corynebacterium Gofmanailidrugihdifteroidov, bakteriološki odgovor otritsatelnym.5 vjerujem. U nekim slučajevima, kada dijagnostički pregled i poepidpokazaniyam, preliminarni odgovor može dati. Etotrebuet postavljanje dodatnih uzoraka, prisustvo kachestvennyhpitatelnyh okruženja, test - sistemi za proizvodnju i Phragmites spetsialnoobuchennogo osoblje. Privremeni odgovor može se izdati više rast slične prinalichii "sumnjiv" koloniyna početni sjetve jela nakon 24 sata inkubacije (vidi. vtoroyden studije, br. 6) .Predvaritelny odgovor može biti promijenjen nakon okonchaniyabakteriologicheskogo issledovaniya.6. Sojeva od Corynebacterium difterije atipichnymimorfologicheskimi, biohemijske, svojstva toksigenih Corynebacterium ishtammy ultserans treba uputiti federalnuyureferens - laboratorija za dijagnozu difterije infekcije priMoskovskom Institut za epidemiologiju i mikrobiologiju im.G.N. Gabrichevskogo za dalja istraživanja (125212 Ul Admiral Makarov, 10.) Shema BAKTERIOLOŠKE ispitivanja1 denPosev issleduemogomateriala na selektivnuyudifferentsialno - dijagnostičke ili, ako je potrebno, vtransportnuyu medij. Inkubacija u inkubatoru na 37sh dan C.2 (24 sata) 1. Studija kolonije, ako je to moguće - na postanovkaproby toxigenicity, tsistinazu i sjetva kulture skoshennyysyvorotochny agar.2. Kada se koristi za transport medij mora biti proizvestiperesev na selektivne diferencijal - dijagnostički sredu.3. Kada je više rast, ako je potrebno, mozhnoprovesti studije za izdavanje prethodnih odgovor -prateći uzorak Pisa, Sachse i usjeva "sumnjiv" koloniyv tečnom mediju za detekciju difterije toksina dan vRNGA.3 (48 sati) 1. Analiza profitabilnosti uzoraka za toxigenicity i tsistinazu postaviti drugog dana studije. Ako nalichiyaspetsificheskih padavina linije i pozitivan uzorak Pizuvydayutdokumentirovannyyotvet dodjelu toksigennyhkorinebaktery difterii.2. Sjetve čista kultura odabranih drugi denissledovaniya, Hiss u srednjem za proučavanje biokemijskih svojstava (saharoza, glukoza, škrob, urea) .3. Ponovna (48 sati) primarni posevavizualno čaše ili pomoću MBS. Staging testovi za toxigenicity, tsistinazu i projekcija kolonija na serum agar.4 beveled. U slučaju transporta okruženja, naravno issledovaniyasm. počinju sa n. 1 drugi dan, a zatim u skheme.5. Vydachabakteriologicheskogootvetaobotsutstviikorinebaktery difterii.6. Prilikom postavljanja RNGA otkriti difterija toksin prinalichii pozitivan rezultat u ovoj reakciji i otkrivanje uissleduemoy kulture tsistinazy enzima odsustvo fermentaureazy može dati preliminarni odgovor na izdvojiti vozbuditelyadifterii.4 dan (72 sata) 1. Računovodstvo za kulturu toksigenih svojstava odabranih u denissledovaniya 3 (nakon 48 sati rasta primarnog sjetve), a odgovor vydachadokumentirovannogo toksigenih korinebakteriydifterii raspodjelu. Sijanja kulture odabrana za određivanje biohimicheskihsvoystv (saharoza, glukoza, škrob, urea) .2. Računovodstvo kulture biokemijskih svojstava (toksigenih ilinetoksigennoy) izdvaja u drugi dan studije (cherez24 sata inkubacije početnog sjetve) .Vydacha bakteriološki odgovor dodjelu netoksigennyhkorinebaktery difterije ukazuje idopolnitelnogo utjelovljenje biohemijske odgovor biokemijskih svojstava difterije toksigennyhkorinebaktery izdvojila ranee.5 dan (96 sata) izdavanje raspodjele bakterioloških odgovora (48 chasovinkubatsii početni sjetve) ili toksigenih netoksigennyhkorinebaktery difterije y Azan biohemijske varianta.4. Metode identifikacije patogena difteriynoyinfektsiiOPREDELENIE toksigenih KORINEBAKTERIYDIFTERII imovinu i koristeći padavina reakcije metodom gel-based za određivanje toxigenicity korinebakteriydifterii (Elek test) leži proces immunodiffuziitoksina pulta i antitoksični antitijela u gustoj hranljive podloge. Umjesto optimalnog kvantitativnog korelacija između toksina produkciji Corynebacterium, i antitoksin nafiltrovalnuyu premazani papir je njihove interakcije sa obrazovaniempretsipitata kao bijele linije ili "brkovi".Toksigennost Corynebacterium difterije određuje, obično u čiste kulture (ili kulture pojedinačnih kolonija sa skoshennogoagara, ili uzorak Pisa). Kolonije mješavina ili kultura zagryaznennyepostoronneymikrofloroy mogu biti testirani natoksigennost. U odsustvu, u ovom slučaju, gel taloži vagarovom iskustvo treba ponoviti sa posebnim chistymikulturami.Dlya produkcijama uzoraka za toxigenicity mora imati: sterilni Petri posudu s ravnim dnom, a hranljive podloge - agarMartena ili suvo komercijalne hranjivu podlogu normalnuyusyvorotku goveda u krvi, sterilne izfiltrovalnoy papir trake mjerenje 1,5 cm x 8 cm, ochischennyyfermentolizom specifične sorpcija i difterije antitoksin (vdalneyshem iz protivotrov) protivodifteriynuyuantitoksichesk th konj serum, terapeutski (u dalneyshemimenuetsya antitoksični serumu), ili završio rad diskis antitoksin primjenjuje na njih, i - kontrolnyytoksigenny Corynebacterium difterije soj 24 - 48 sati rosta.Prigotovlenie čaše za postavljanje probyna toksigennostPitatelny agar kako bi se utvrdilo toxigenicity tselesoobraznorazlivat cijevi 10 ml (iznos potreban dlyaprigotovleniya jedan kup). Kada je veliki obim posla pitatelnyyagar rasporedi u bočice u 70 - 80 ml (7-8 uzorka šolje natoksigennost). Nutrijent agar treba rasplavlivat tolko1 više različitih topljenje narušava svojstva medija. Pitatelnyyagar rasplavlivayut u kadi vode na 90sh C, odmah ukloniti izbani, hladi na 50SH C i dodajte 20% seruma krupnogorogatogo goveda. Dakle, do 10 ml nutrijenata agar je dodao 2 mlsyvorotki goveda, izazvao i sipao aseptično u sterilnu petri posudu, na dno raspredelyayutsosedu pažljivo rotacije chashki.V centru kup na površinu utvrđenju agara obozhzhennympintsetom postavljen traka filter papira propitannuyuantitoksinom ( ili antitoksični serumu) .Chashku sušene u pećnici na 37sh C za 15 -20 min., okretati naopako. Kada koristite bumazhnyhindikatornyh vozi nutrijent agarom sušeno donaneseniya sredy.Chashki diskova na površinu medija kako bi se utvrdilo toxigenicity prodavnicu nerekomenduetsya.Prigotovlenie papir polosokPoloski filter papir izrezati na veličinu od 1,5 cm x 8 cm, omotan sa 2 - 4 komada u torbu i sterilizirana u avtoklavepri 0,5 bankomat za 30 minuta. Kese sa papira poloskamihranyat u sterilnom petri posudu do 3 nedel.Pered uzoraka staging da toxigenicity santitoksinom sadržaj bočice se rastvaraju u 1 ml sterilne fiziologicheskogorastvora, prebačen u sterilnu epruvetu i ukazuju neydannye oznaka (raspušten antitoksin temperature 4 čuva na - 6sh C koji ne prelazi 10 dana) . Filter papir obozhzhennympintsetom stavlja u sterilnu petri jelo. Na svakom poloskunanosyat antitoksin 0,25 ml sadrži 500 ME u 1 ml. Dlyaudaleniya višak serum natopljenom traka primijeniti ksterilnoy kup poklopac Petri.Pri koristeći antitoksični seruma (vmestoantitoksina) zahtijeva njegovo razrjeđivanje do 500 ME 1 ml.Razvedenie antitoksični syvorotkiSoblyudaya aseptične tehnike, antitoksični perenosyatiz serum bočica u sterilnu epruvetu. Na cijev ukazuju dannyeetiketki i rok trajanja. Čuvajte serum na 4 -6sh C.Syvorotka mora biti razblažen sa sterilnim sadržajem fiziologicheskimrastvorom do 500 ME u 1 ml. Komercijalnog preparata mozhetimet različite aktivnosti (5000 ME, 10000 ME, 20000 ME) i razlichnyyobem.Naprimer u ampuli sadrži 10000 ME (u volumenu od 4,8 ml, kakukazano etiketa kutija s ampulama) antitoksični syvorotki.Dlya pojednostaviti proračuna, u ukupnom iznosu od seruma može biti uzeti ZA5 ml. Shodno tome, u 1 ml seruma sadrži 2000 ME (10000 ME: 5 = 2000 ME). Da biste dobili 500 ME u 1 ml sleduet1 ml seruma razblaženi 4 puta, i.e., do 1 ml seruma dobavit3 ml sterilnog rastvora. Kada neobhodimostimozhno razrijeđen serum u manje volumene: 0,1 ml syvorotkidobavit do 0,3 ml slane ili 0,2 ml syvorotkidobavit 0,6 ml slane ili 0,3 ml syvorotkidobavit 0,9 ml fiziološke otopine i t. d.Razvedenie serum se može učiniti na drugi način. Ako, na primjer, sadržana u ampuli 5000 ME serum u zapremini od 2,5 ml, ME 500 sadržana je u 0,25 ml seruma. U ovoj knjizi dobavlyayut0,75 ml sterilne slane i serum poluchayutrazvedenie 500 ME 1 ml.Razvedennuyu u serumu mogu biti pohranjeni za 7 dana na temperature 4 - 6sh C.POSTANOVKA PROBYKulturu posejane u "plakete" promjera 0,6-0,7 cm narasstoyanii 0,7-0,8 cm, osim i 0,5 cm od ruba poloskifiltrovalnoy papir. Jedan kup ne treba zasađeno više od 10 "plakete". Od tog broja, 6 "plakete" test kultura 4 -kontrolnogo naprezanja. Kada mala količina inokulisane ispytuemogomateriala 6 kontrola "plakete" i 4 - subjekti (Slika 1. *>). Čaše sa setvu je stavljen u termostat na 37sh C .-------------------------------- *> Nije privoditsya.Uchet rezultatovRezultat pročitati na 18 - 24 i 48 sati rosta.Sleduet može shvatiti chtopreparatantitoksicheskoyprotivodifteriynoy serumu, osim difteriynomuantitoksinu antitijela sadrži antitijela na antigene u formulaciji mikrobiološke kletki.Poetomu uzorka toxigenicity ispolzovaniemdannogo sa taloga droge može biti formirana ne samo vrezultate povezivanje toksin sa antitoksin (spetsificheskiepretsipitaty), ali iu interakciji antibakterijskih antitijela skomponentami Corynebacteria ćelije d ifterii (nespetsificheskiepretsipitaty). Potonji može biti formirana kao toksigenih, pogrešno broj i kontrolnog soja, a na netoksigennyhkorinebaktery difterije. Ponekad je izgled mnozhestvennyhliny padavina. Nespecifičan taloga obično blage, imaju nejasne konture pojaviti najviše 48 -72 sati, u rijetkim slučajevima može se pojaviti na prvi sutki.Kriteriem procijeniti specifičnost fuzije taloga je liniypretsipitatsii test soj sa specifičnim liniyamikontrolnogo toksigenih naprezanja. U slučajevima u kojima ukontrolnogo soj formirali nekoliko linija padavina, specifičnih treba smatrati točniji i rano poyavlyayuschiesyapretsipitaty. Stoga, pregled uzorka čepovi toksigennostosuschestvlyayut nakon 18 - 24 sata od trenutka njegove proizvodnje. Ako vtechenie ovaj put iz kontrolnog soja pretsipitatsiine linije su otkriveni, to predstavlja kršenje usloviypostanovki reaktsii.Varianty procijeniti odgovor rezultata: 1. Test kultura Corynebacterium difterije yavlyayutsyatoksigennymi ako oni čine padavina linije spajaju iliimeyut tendenciju da se spoji sa relevantnim kontrolu spetsificheskimiliniyami toksigenih shtamma.2. Test kultura Corynebacterium difterije yavlyayutsyanetoksigennymi ako: a) liniju padavina formirala test kulture, u odsustvu prisustva specifičnih linija padavina ukontrolnogo soj b) linija padavina ne može spojiti sa spetsificheskimiliniyami kontrole padavina soj i prešli ili imeyuttendentsiyu ukrštanjem sa njima (identični , nespetsificheskielinii) -c) linija Talog test kulture snespetsificheskimi linije spajaju kontrolnog soja-d) padavine test linija kult URS sospetsificheskimi linije ukrštaju i spojiti s nespecifičnim liniyamikontrolnogo shtamma.Ochischenny enzimske hidrolize i specifične sorpcije antitoksin Ne sadrži antitijela na komponente mikrobiološke ćelija. Kada ispolzovaniietogo priprema nespecifični Talog linija ne obrazuyutsya.METODIKA toksigenih SVOYSTVKORINEBAKTERY ODREĐIVANJE difterije INDIKATORNYHBUMAZHNYH disk sa ANTITOKSINOMNa Petri jelo površinu medij za mikrobiološke postavljen opredeleniyatoksigennosti difterije pokazatelj točka sdifteriynym protivotrov. Oko svaki disk 5 antitoksinomformiruyut "plakete": dva "plakete" - kontrolni soj i tri -ispytuemye (jedna analiza najmanje dva sumnjivo koloniyamiformiruyut "plakete" iz izolovane kolonije i -od mješavinu 3-6 koloniy- sličnih fotografija iz istog analizamozhno se održati na drugu disk protivotrov). svih pet"plakete" su raspoređeni simetrično oko diska na udaljenosti od 0,8 smot ivicu. Promjer svakog "plakete" 0,8 cm. Na jednoj kup Petrimozhno primiti do četiri diskova antitoksin i odnosno 20 "plakete" kulturama. Čaše sa posevamipomeschayut u termostat na 37sh C.Rezultat reakcija pročitati na 18 - 24 sati, a od 48 sati -Kroz. Prisustvo padavina linija između diska santitoksinom i test kultura pokazuje eetoksigennosti. Studija je smatrao toksične kulture, ova kultura esliliniya padavina spaja pod uglom sa linieypretsipitatsii kontrolnog soja. Nedostatak padavina linija uispytuemyh kulture nakon 48 sati, ukoliko imaju kontrolnyhshtammov ne ukazuje na toxigenicity imaju izuchaemyhkultur. Talog linija u kontroli sojeva dolzhnypoyavlyatsya nakon 18 - 24 sati. Kasnije pojave liniypretsipitatsii zahtijeva provjeru hranljivi kontrolu kvaliteta srednje ilizameny shtamma.Hranenie kontrolnog soja u laboratoriiDlya kontrolu skladištenja soj u laboratoriji mozhnoispolzovat polutvrda agar serumu pripremljen nabulone Martin ili drugih nutrijenata bujon (pH 7,6). Držite vholodilnike presađivanje jednom od 2 - 3 mjeseca. Polu tečni agarrazlivayut 8 ml cijevi i 1 ml goveđeg syvorotkikrupnogo skota.Kontrolny toksigennyyshtammkorinebaktery difterije utjelovljenje gravis dobiti u Državnom institutu za standardizaciju ikontrolya medicinskog i biološkog preparatovim.L.A Research. Tarasevich. Na suđenju na toxigenicity ne može koristiti vkachestve kontrole, proizvodnja soj PW-8 i da je neophodno da se povremeno varianty.Kontrolny naprezanja passaged na krovyanomagare. Za uspješnu identifikaciju Corynebacteria difteriikontrolny toksigenih soj potkulturom svaka 1-2 sutok.METODIKI DEFINICIJE PRIZNAKOVOPREDELENIE TSISTINAZNOY BIOHEMIJSKE DJELATNOSTI (PRIMJER Pisa) Corynebacterium difterije i Corynebacteria ultserans, unlikefrom lozhnodifteriynoy Hoffmann i druge šipke korineformnyhbaktery posjeduju enzim tsistinazoy.Ispytuemuyu kulture inokulisane petlje "ubod" . U pitatelnuyusredu za određivanje tsistinazy, sipa u uskim visina probirkistolbikom 3 cm od hranljive podloge sastavu ima cistin octene - kiselina u korist domaćina. Tokom kulture rast produtsiruettsistinazu, paranje tsistin- i formirana na etomserovodorod reagovao octene - kiselina olovo, sumpor u kotoryyprevraschaetsya - olovnih - spoj -Brown tamne boje. Corynebacterium difterije i korinebakteriyultserans uzrokuju zacrnjenja ne samo medija tokom ubrizgavanja, ali iobrazuyut tamni oblak oko njega - smeđa narasstoyanii oko 1 cm od srednje površine. Reaktsiiuchityvayut rezultate nakon 24 sata. U prisustvu više dlyapolucheniya rast ubrzan odgovor (preko 3 sata), kultura srednje inokuliruyutbolshim iznos. Istovremeno ispytuemymikulturami, sjetve vrši se u kontrolu soj otdelnuyuprobirku.OPREDELENIE ureaze AKTIVNOSTILozhnodifteriynye Hoffmann coli, Corynebacterium ultserans inekotorye drugih mikroorganizama iz roda Corynebacterium za proizvodnju obladayutsposobnostyu tokom rasta irasscheplyat enzima ureaze urea. Corynebacterium difterije takva mogućnost neobladayut.Probu ureaze može se staviti u dvije varijante - po metoduZakse (a) i što se nasadi na bujon s ureom (b) .a) Za način ureaza Sachse Extempore smeshivayut1 dio reagensa A i 19 dijelova reagensa B. smjesa se sipa u 0,1 ml uzkieprobirki što jedan petlje i testirati čisto kulturyso agar nagib cijevi ili sa Pisa srednje. Za odgovor vydachiuskorennogo u prisustvu više rast na pločici odnotipnyhkolony početni sjetve, kolonije dozvoljeno vnesenieneskolkih jedan uzorak cijev ureaze. Rezultatuchityvayut nakon inkubacije u inkubatoru na 37sh C u trajanju od 30 min.b) Pure kulture Corynebacterium difterije u smochevinoy inokulisani čorba, sipa u epruvete u od 2 - 3 ml, i smještena u inkubator, rezultat u 24 sata inkubacije na 37sh C.Ferment ureaze Cleaves iuglekisloty urea da formiraju amonijaka. To povećava pH medija i javlja izmenenietsveta indikator (crvenilo). U nedostatku ovog enzima issleduemoykultury, srednji ne bojenje proiskhodit.Rekomenduetsya istovremeno u posebnom cijevi, zasevatkontrolny shtamm.OPREDELENIE saccharolytic AKTIVNOSTIDlya identifikaciju Corynebacterium difterije takzheotsenku koristiti saccharolytic aktivnost izoliranih kultura za sredahGissa ugljikohidrata - saharoza, glukoza, topiv krahmalom.Kazhduyu cijevi sa srednjim Hiss je inokulisana 1 petlje chistoykultury. Rezultat u 24 sati, a na otritsatelnomkrahmalnom znak - formira kiselina, tu je obnova decolorized Fuksin i sredapriobretaet boja grimizno nakon 48 sati kulture usjeva vtermostate na 37sh C.Pri fermentacija ugljenih hidrata. Preporučena stavitprobu istovremeno sa kontrolnog soja Corynebacterium difterije variantagravis.OPREDELENIE nitrat reduktaze AKTIVNOSTISposobnost Corynebacterium difterije vratiti soliazotnoy kiselina (nitrata) u soli azotasta kiselina (nitriti) je opcionalna funkcija koja omogućava differentsirovatkorinebaktery ultserans.Proizvodyat sjemena kulture pod studija u epruveti s nitratnymbulonom, inkubirani 24 sata na 37sh C.Zatem dodao od 2 - 3 kapi reagensa za nitrita (Grisu iliKasatkina ). Ako je bilo formiranje nitrita, sredaokrashivaetsya crveno. Ako ne obladaetnitratreduktazoy mikroorganizama, srednji ne diskoloracije proiskhodit.Odnovremenno s epruvetama, inkubirani kontrolnuyuprobirku sterilni sredoy.5. SredyKachestvo hranljive podloge je od suštinskog značaja kada studija lyubombakteriologicheskom. Da bi se postigla maksimalnoyvysevaemosti Corynebacterium difterije testa materijala, potrebno je stvoriti optimalne uvjete za rast, reprodukciju očuvanje etihbaktery njihovih bioloških svojstava, kao i dlyaingibirovaniya prateći rast mikroflore. To dostigaetsyaputem koristiti univerzalni nutrijent baze sa dobavleniemkrovi i kalijum tellurite. Kalijum tellurite u opredelennoykontsentratsii ne sprečavaju rast predstavnika rodakorinebaktery i gotovo u potpunosti inhibira medij rasta postoronneymikroflory.Krovyanyetelluritovye takzhedifferentsialno - dijagnostički kao koloniikorinebaktery na ovim mediji imaju sive ili crne boje (ovi mikroorganizmi su u mogućnosti vratiti kalija tellurite dometallicheskogo telurijum crne supstance, i akumulira egovnutri ćelija) .NPO "hranjivoj podlozi", Mahačkala suhuyuhinozolnuyu proizvodi diferencijal - dijagnostički srijeda Buchina dlyavydeleniya Corynebacterium difterije, koji je pripremljen od strane recept naetiketke dopunjen s 5% krvi (ne dobavleniesyvorotki umjesto krvi). Buchina srijeda inferioran krovyanymtelluritovym srijedom za inhibitorne aktivnosti i koloniivozbuditelya difterije može se pojaviti dan kasnije nego nakrovyanyh telluritovyh okruženja. U posljednjih nekoliko godina, Institut za istraživanje prikladnoymikrobiologii (.. N Obolensk Moskva regija) proizvodi pitatelnuyusredu da izoluje Corynebacterium difterije - korinebakagar.Odnako, u odnosu na krv telluritovymi okruženjima dannoysrede da raste u 2 - 3 puta manja kolonija korinebakteriydifterii.Uchityvaya gore, ipak, pitatelnymisredami najbolje za primarnu inokulaciju materijalu su krovyanyetelluritovye medij. Kao osnova za te medije mozhnoispolzovat suho nutrijent agar (SPA) NPO"hranjivoj podlozi" (Mahačkala) na nutrijenata agar osnovepankreaticheskogo hidrolizat, riblje brašno (RM) proizvodnja GNIIPM (n. Obolensk). Nutrijent agar priprema etiketa recept iextempore dodao krvi i tellurite kaliya.Dlya određivanje toksigenih svojstva Corynebacteria difteriivypuskaetsya komercijalne suho srijeda OTDM (NVO "Pitatelnyesredy"..., Mahačkala) i GNIIPM (n Obolensk Moscow region) medija podataka koju je pripremio recept etiketke.Luchshey na osnovu pripreme uzoraka životne sredine i za opredeleniyatoksigennosti Pisa ostaje otvorena ognjišta pepton, kotoryygotovitsya u laboratoriji ili u odjelima nutritivnih srednekotoryh naučno - istraživačkih ustanove za prigotovleniyaMartenovskogo agara.Dlya napuštanja kolonije i gajenje Corynebacterium uvjetima difterije vlaboratornyh pripremiti serum agar sredu.Primenenie serumu oduzet netseleso braznym.Kazhdaya nova serija kulture srednje (obje komercijalne iprigotovlennoy in vitro) podlezhitbakteriologicheskomu kontrole. U slučajevima kada hranljive podloge rostovyesvoystva ne zadovoljavaju predyavlyaemymtrebovaniyam, nutrijent agar baze pripremljen čorba -suhoy nutrijent bujon (SPB) proizveden od NPO "Pitatelnyesredy" (Mahačkala), tajming-bulonproizvodstvaGNIIPM (n Obolensk.) - čorba aminopeptide za mikrobiološke tseleyproizvodstva klaonicama (grad Sankt Peterburg, Krasnodar, Stavropol ') i čorbe, pripremljene u laboratoriji (Hottinger Digest, pepton 1% vode, sadržaj aminnogoazota 150 -. 180 mg /%) kultura medija za inicijalnu sjetve sloj chashkamPetri sipa u 3 - 4 mm. Oni se mogu koristiti u techenie3 dana ako se čuva na pripremu temperaturi 4sh C.METODY I hranjivoj podlozi REAKTIVOVTRANSPORTNAYA medije (mediji AKUMULACIJA) kao osnova za pripremu transportnih sredyispolzuyut 0,1% nutrijenata agar na Hottinger vari ili 0,1% agar komercijalne nutrijenata čorba, pH 7,6.0,1% bazi agar se sipa u epruvete u 4 ml sterilizuyutv autoklavu na 1 atm za 20 minuta. vrijeme čuvanja - do 1 mjesec na 4sh C. Prije upotrebe svaku epruvetu ssoblyudeniem aseptične tehnike, dodan je 0,5 - 1,0 mL syvorotkikrupnogo goveda i 0,05 ml (1 kap) 2% kalijum rastvoratellurita. Selektivno kontrolirati okoliš steriliteta održavanja na 37sh C za 48 sati. Rok trajanja gotovoysredy - 10 dana 4sh C.ZHIDKAYA hranjivu podlogu za tvrdnju svrhu RNGAS difterija toksin indikacija RNGA materijal chashkipervichnogo sjetvu inokuliše u epruvetu sa tečnom mediju syvorotochnoypitatelnoy pripremljen na čorbu Martin, ssoderzhaniem amin azota od 150 - 180 mg /% pH 7,6. Pitatelnyybulon sipa u epruvete u 3,5 ml, sterilizirana u autoklavu pri1 bankomat. za 20 min. rok trajanja - do 1 mjesec. na temperature4sh C.Pered potrošnje svaku epruvetu s obzirom pravilaseptiki dodao 0,5 ml goveđeg seruma i0,05 ml (1 kap) 2% rastvor kalijum tellurite. Kontroliruyutna sterilni medij i čuvaju na isti način kao i za primarnu polutečan transportnuyusredu.SREDY sjetve ispitivanog MATERIALASreda Clauberg IIK 100 ml sterilne nutrijenata agar baze (pH 7,6), topljeni i ohladi na 50SH C, glitserinovoysmesi 10 ml, 50 ml "lak" Krvi i 3 mL 2% rastvora tellurite kaliya.Prinimaya u obzir da su hranljive podloge i mješavina razvoditsyaglitserinovoy "lak" krv u 1,6 puta dati medij priprigotovlenii bi trebalo da poveća težio suhogopitatelnogo agar proračun 1.6 raza.Primer. Etiketa na bočicu sa suhim kommercheskimpitatelnym agarom sadrži težio je potrebno za prigotovleniyaodnogo litar srednjih D. Na primjer 30 Priprema 1 litrapitatelnoy osnova za Clauberg II srednje treba uzeti navesku48 g (i.e. 30 g x 1,6 = 48 g) .Za hrane glicerin mješavina do 40 ml krvi ili defibrinirovannoykrovi mješavina je dodan 20 ml hemijski chistogosterilnogo glicerina (glicerola sterilizirana na 110sh temperaturi Savanoriu Str za 30 min.). za pripremu "lak" Krv sterilnoydistillirovannoy do 34 ml vode je dodao 16 ml defibrinated krovi.KROVYaNOY TELLURITOVY AGAR (KTA) da 100 ml sterilne nutrijenata agar baze (pH 7,6), topljeni i ohladi na 50SH C, dodan je 7 ml 10 mldefibrinirovannoy ili hemolizovani krvi i 2ml 2% rastvor kalijum tellurite. Umjesto toga, krv se može koristiti suhuyutelluritovuyu smjesa (11 ml na 100 ml srednja), dok je na 100 mlKTA Extempore dodao 1 ml 2% rastvor kalijum tellurite, t.k.1 ml 2% rastvora se već nalaze u krvi telluritovoysmesi 11 ml. Uzimajući u obzir da je hranljive podloge razvoditsyakrovyu oko 1,1 puta, u pripremi srednje sleduetuvelichit težio suho nutrijenata agar proračun 1.1 raza.Primer. Etiketa na bočicu sa suhim kommercheskimpitatelnym agarom sadrži težio je potrebno za prigotovleniyaodnogo litre medij, npr, 30 F. Za pripremu 1 litrapitatelnoy osnova za CTA mora uzeti uzorak od 33 g (i.e. 30 g x1,1 = 33 g) .METODIKA PRIPREMA KROVYANYHI KROVYANO - TELLURITOVYH SMESEYDlya priprema hranjivoj podlozi najbolje ispolzovatdefibrikirovannuyu krv životinja - goveda, konji, svinje, ovce, zečevi. Krv je prikupljena u sterilnyesosudy sa perlama pomoću posebno montiran sistem aseptično. U nekim slučajevima, krv je prikupljeno, nemontiruya specijalne sisteme, spajanjem prvu krv obrok vnebutyli.Mozhno korištenje ljudske krvi istekao (citrat i konzervansa) priprema nje spetsialnyekrovyanye mješavina. Za to je potrebno ukloniti tekućine krv chastotstoyavsheysya sadrži natrij citrat i konzervansa. Kostan eritrocita mase u posudi dodati sterilnyyfiziologichesky rješenje koje također može ukloniti posleosedaniya eritrociti, i dodati destilovane vode dopervonachalnogo obema.Horoshim syremdlyapolucheniya mješavina krvi sluzhiteritrotsitarnaya masu koja može ostati kada proizvodstvegammaglobulina i drugih proizvoda od krvi. Na eritrocita massedobavlyayut sterilne destilirane vode po stopi od 1/3 obemaeritrotsitarnoy massy.Mozhno također koristiti krvnih ugrušaka preostalih posleserologicheskih reakcije (uz negativan rezultat reakcije), ugrušci ili abortnoy placente krvi. Vsterilnye ugrušaka prikupljanje boca sa staklenim perlama i slomljenog stakla, a zatim smrznuto i odmrznuti, zatim ugrušci lako razbivayutsyabusami. Ovaj postupak se može ponoviti od 2 - 3 puta. Onda dobavlyayutsterilnuyu destilirane vode po stopi od 1/4 volumena krvi sgustkov.V mješavine koju je pripremio gore metodom, kalijum tellurite je dodan kao konzervans. Za svakih 10 mlkrovyanoy mješavina je dodan 1 ml 2% rastvor kalijum tellurite. Takuyukrovyano - telluritovuyu mješavina se može čuvati na 4sh C w2 mesyatsev.Primer proračuna. Osim ako supernatant citriranu krvi obemom250 ml 50 je uklonjena - 60 ml tekućine dijela, a zatim neobhodimodobavit isti broj - 50 - 60 ml sterilnogofiziologicheskogo rješenje promiješati ponovo pusti štand, nakon čega ukloniti 50 - 60 ml tekućine dijela i do 50 - 60 mlsterilnoy destilirane vode. Dakle, to će polucheno250 ml mješavina krvi. To je neophodno za očuvanje dobavit25 ml 2% kalijum tellurite (za svakih 10 ml smesipribavlyayut krvi 1 ml 2% kalijum tellurite) .U dalje u pripremi krvi telluritovoy sredyna svakih 100 je dodao 11 mL krovyanoytelluritovoy smjesa (10 ml mješavina krvi i 1 ml ml nutrijenata agar rastvoratellurita 2% kalijum). Extempore na takav medij je dalje dodao 1 ml 2% rastvora kaliya.Prigotovlenie tellurite rješenje tellurite kaliyaDlya telluritovyh mediji koriste spreman kommercheskiy2% rastvor tellurite kaliya.Pri odsustvu komercijalno dostupnih tellurite rješenje kaliyagotovyat slijedi: 100 ml destilirane vodyrastvoryayut 2 g kristalne kalijum tellurite. Za sterilizatsiirastvor zagrijava u kipuću vodu za kupanje u trajanju od 30 min. i zadržati pritemperature 4shC. Kristalnog kalij tellurite hranyatgermeticheski zatvorene banke tamno stekla.SYVOROTOChNY AGARSyvorotochny agar koristi za skrining kolonija ikultivirovaniya Corynebacterium difterije, može se pripremiti Ljubav Dosta od gore navedenih nutrijenata osnov.K 100 ml rastopljenog i hladi do temperature 50SH Cpitatelnogo agar (pH 7,6) sterilne 10 ml syvorotkikrupnogo goveda. Srednji je izazvao, sipa vsterilnye cijevi za 4 - 5 ml, i postaviti ih u naklonnompolozhenii za nagib svaku seriju kotorogoproveryaetsya sterilitet. Nekoliko cijevi se postavljaju u noći termostat. U slučaju klijanja srednje je odbacio sve nagnuti partiya.Probirki serum agar čuvati na 4sh C w2 nedel.MARTENOVSKY agar VODOYDVOYNOY KONTsENTRATsIIMartenovsky Meso pepton - 0,5 l, meso voda - 0,5 l, agar -agar - 15 g octene - kiselina natrij - 5 g, maltozu - 3 g.15 g agar oprati tokom radnog dana protochnoyvodoprovodnoy u vodi, isušeno i pažljivo prenose u 1 lmartenovskogo čorba (0.5 l ognjišta pepton i 0,5 l myasnoyvody). Prilagođeni pH 7,8-8,0 po Alkalizing bulona20% rastvor NaOH na papir sa kresoli crveni indikator, koji u ovoj reakciji mijenja boju u žutu roze -malinovy. Bujon je refluxed za 10 min. zatim 0,5% (5 g na 1 L) octene - kiselina natrij, 0,3% maltoza (3 g na 1 L), pH se provjerava i, ako je potrebno, ponovo prilagođen na 7,8 - 8.0, grijani . vtechenie 15 minuta, ostaviti da odstoji na toplom mestu (u vozilu Koch termostat) od od 2 - 3 sata i filtrira kroz pamučnom krpom ili -marlevy filter. Dozira u sterilne bočice (70 - 80 ml) pribolshom opterećenja ili cijevi (10 ml) i sterilizuyutodnokratno teče pare za 30 min.Martenovsky peptonSvinye stomaka, po mogućnosti u kombinaciji sa elastičnim zidove, velike količine sluzi i kataralne simptoma bez pročišćene otzhira (želuci impregnirane žuči odbacuju), smanjiti iizmelchayut brusilica. Rezultirajući mljeveno stomak stavlja vbutyli kapaciteta 3 - 5 litara i grijani sipati 50SH C vodoyiz na osnovu 1 litru vode 300-500 g na mljeveni mase. Postoji zhedobavlyayut 1% hemijski čistu klorovodične kiseline (specifične težine 1,19). Mass izazvao dobro i staviti u termostat, bilo na 15 -18 sati (ili više) na 37sh C- ili, ako je otdelnogotermostata 42sh C, 18 sati (ili više). Tokom protsessaperevarivaniyabutyl češće potreseni na prvi (nakon 1-1,5 sati), a zatim rjeđe. Dobro vari pepton butylilezhit mali donji sloj fine tamne osadka.Polnotu taloženje balast proteini mogu provjeriti putemdobavleniya do 5 ml filtrirane pepton 1-2 kapi 10% NaOH, mutnoća ne bi trebalo da poyavlyatsya.Deystvie enzim se zaustavlja grijanje u vodenom kupatilu, postepeno dovodeći temperature 80sh C, popokazaniyu osnovana sa termometar uronjen u boci perevarom.Nagrevanie nastavilo 10 min. Za tu svrhu, uređaj mozhnoispolzovat Koch ili autoklav. Tschatelnovzbaltyvayut boce, zatvorena sa pamukom - gaze sa bumazhnymkolpachkom čepom i staviti na hladnom suhom mjestu za otstaivaniyapri temperatura nije viša 12sh C. pepton upotrebljiv neranee od 7 dana kada čvrsto poravnati suspendovan chastitsy.Neobhodimo dodati 20 ml kloroforma do 1 l pepton dlyakonservirovaniya i zatvorite bocu s gumenim čepom. Ovo videpepton mogu biti pohranjeni bez sterilizacije na sobnoj temperature.Myasnaya vodaDlya meso za kuhanje vode dvostruke koncentracije zhelatelnoispolzovat svježe meso mladih životinja upitannosti.Obezzhirennoe medij oslobođen od mesa tetive prošlo cherezmyasorubku, sipati vodu u 1 litra vode na 1 kg mljevenog iostavlyayut preko noći na 4sh C, smeša je grije na jutro asbestovoysetke za 15-20 min. od trenutka ključanja. Spremni otvarfiltruyut, mljeveno isušeno, rezultirajući meso se sipa vsterilnye bocu s vodom 250-500 ml i sterilizirana tekućine parom3 uzastopna dana do 30 min. Skladišti na 4sh indikator C.Bumazhki Cresol krasnyy0,1 g Cresol crvenim su rastvoriti u 100 ml 95% alkohola na temperaturi iostavlyayut 37sh C za 24 sata, često sa trese. Dan nasleđe natopljenom u otopini filtrovalnoybumagi trake i brzo suši. Bright - Žuta radova boja schelochnoysrede prihoda u različitim nijansama krasnogo.SREDY ZA ODREĐIVANJE TSISTINAZNOY AKTIVNOSTISreda Pisa na OHF agareK 90 ml rastopljenog 1,5% agar OHF (nije dozvoljeno korištenje Hottinger agar), pH 7,6, dobavlyayut2 ml 1% otopina L -tsistina je 0.1N rastvor solne kiseline (HCl), dobro promešati i isti obim 0.1N rastvoraNaOH za neutralizaciju kiseline. Kiseline i alkalne rješenja dolzhnybyt međusobno titered, ispolzovatfiksanaly se može proizvesti kemijski promyshlennosti.Sredu sterilizirana na 112sh C u trajanju od 30 minuta, skladište za 1 mjesec na 4sh C.Agar sa cistin istopila na 90sh C (srednji ne provri -. Dlyasohraneniya cistin). Na hlađenje srednje dodao 45sh C 1 ML10% olova acetata rješenje i 9 ml seruma krupnogorogatogo goveda aseptično i flaširana poprobirkam.Neobhodimo Imajte na umu da kada je temperatura 50SH C i više, u prisustvu olovo acetata, i serum oblačno sredapriobretaet milky boje. Teško je na račun rezultatovreaktsii.Sreda Pisa-based poslovnom okruženju AGVDlya Pisa kuhanje srednje mogu biti dostupne na sastav komercijalne isbalansirovannuyu AGV medij koristi vbakteriologicheskoy praksa da se odredi chuvstvitelnostimikroorganizmov na antibiotike. A težio dio suvom AGV vkolichestve 2,7 g je uveden u 90 ml destilirane vode i grijani đóęč potpuna raspada. Pripremite 5% natriya.Dlya hidrogen rješenje je raspušten 0,5 g NaHCO u 10 ml destilirane vody.Zatem rješenje je dodan 0,1 g L-cistein i grijani na polnogorastvoreniya cistin. Zatim 2 ml ključale alkalnih rastvoratsistina uvodi u 90 ml rastopljenog srednje AGV, pH prilagođen, i sterilizirana na do7,6 112sh C 10 min. Na rastopljenom iohlazhdennoy 45sh do C kroz sukcesivno dodaju: 10 mlsyvorotki goveda, 1 ml 10% rastvorauksusnokislogo olova, svježe pripremljene 1,5 mL sterilne 10% natrij tiosulfata i sipa u probirkam.Rastvory olovo acetata i natrij tiosulfata gotovyatextempore pomoću sterilne epruvete i destilirana voda sterilizirana teče pare, ili u kadi vode za 30 min.Danny variantsredy Pisa otsutstviiMartenovskogo koristi u agar. Odnakoneobhodimouchityvat, chtodifferentsialno - dijagnostička svojstva ove sredine comparisonwith medij pripremljen na agar OHF manje vyrazheny.SREDY ZA ODREĐIVANJE ureaze AKTIVNOSTIProbu ureaze može se staviti u dva oličenja: metoda Sachse Iput inokulacije u čorbu sa mochevinoy.Prigotovlenie opredeleniyaureaznoy reagense za aktivnost metoda ZakseGotovyat reagens 2 - A i V.Reaktiv A: Urea 2% etil alkohol G96 2 mlDistillirovannaya 4 mlReaktiv voda B: 0,2% rastvor fenolrot 1 mlOdnozameschenny kalijev fosfat (KH PO) 0,1 r2 4Dv polako kalijum fosfat (K HPO) 0,1 gHlorid natrija (NaCl) 2 40.5 gDistillirovannaya voda100 mlReaktiv A nije sterilizirana i čuva na 4sh C.Reaktiv je sterilisati tečni parom.Bulon mochevinoyK sa 100 ml sterilne mesa - ili pepton Hottinger čorba (pH 7,0) je dodan 1 g uree, i 0,2 ml 1,6% alkohola rastvoraindikatora krezolrot. Sipa u od 2 - 3 ml sterilne epruvete sterilizirana teče pare za 10 min.SREDA ZA ODREĐIVANJE saccharolytic AKTIVNOSTIDlya određivanje saccharolytic aktivnost rekomenduetsyaispolzovat srednjih 1% pepton vode.K 100 ml tople destilirane vode je dodan 1 g pepton, 0,5 g hemijski čista NaCl i indikator 1 ml Andrede.Ustanavlivayut pH 7,4, kuhano za 5 min., filtrira kroz filter papir ilipolotnyany, prilagođena zapremine goryacheydistillirovannoy vode. Da bi se ovo je dodat jedan osnovu izuglevodov saharoze, glukoze (1 g), škrob (0,5 g) .Among sipa u epruvete u od 2 - 3 ml i sterilizirana tekuchimparom za 3 dana do 30 min. ili 0,5 bankomat. 30 min. Gotovyesredy pokazatelj Andred su bezbojna ili blago rozovatyyottenok.Indikator AndredePosuda za pripremu indikatora treba biti suha, kemijski čista, sa prizemljem probkoy.K 100 ml destilirane vode dodaje se 0,5 g kiseline fuksinai 16.4 ml 4 posto NaOH. Rješenje za dan ostavlyayutpri 37sh C, povremeno trese, dva dana držali Pomoću jednostavnih savjeta, a zatim ukloniti na tamnom mjestu. Svježe pripremljenih rastvorimeet slame - žute ili blago ružičasta nijansa, kotoryyischezaet tokom skladištenja. Kada intenzivno - roze okraskerastvora tokom indikator kuhanja mora dobavitesche 1,6 ml 4 posto rješenje NaOH.SREDA ZA ODREĐIVANJE nitrat reduktaze AKTIVNOSTIK 100 ml nutrijent bujon (BCH ili Hottinger čorbu) pH 7,3 - 7,5, bez nitrita (provjera Grissaili Kasatkina reagens) dodaje se 0,1 g besplatno nitratakaliya nitrita (KNO). Provjerite ponovo za nitrita PO32 ml i izdaju u hemijski čiste, suhe epruveta. Srednji je sterilizirana 15 min.pri 120sh C.Reaktiv GrissaRastvor 1: 0,8% Sulfanilna kiseline u 5N octena kislote.Rastvor 2: 0,6% alfa-dimetil-5N uksusnoykislote.Pered naftalamin u obavljanju reakcija mješavina jednake količine rješenja 1 i 2. reagens podoban za upotrebu za 15 minuta, bezbojna, pripoyavlenii ružičaste mrlje -. neupotrebljiv. Rješenja 1 i 2 hranyatpri 4sh C za 2 mes.Reaktiv KasatkinaRastvor 1: 0,1% rastvor u destilovanoj rivanola vode.Rastvor 2: 12% rastvor solne kiseline (HCl) .Prior obavljanje reakcija mješavina jednake količine rješenja 1 i 2. reagens Goden za upotrebu u roku od 15 min. Rješenja 1 i 2hranyat na 4sh C za 2 mes.RETsEPTY KRASOK1. Alkalne metilen plavo Lefflera.Distillirovannaya LVO1 99% vodenog rastvora kalijum hidroksida (KOH) 1 ML10% alkohola rješenje metilen plavo 30 mlSmeshat. Mrlje za 1 - 2 min.2. Acetic siniy.Toluidinovy ​​toluidin plave gLedyanaya octene kislota2 0,5 ml96% etil alkohol 5 100 mlSmeshat mlDistillirovannaya vode. Mrlje za 3 - 5 min.3. Crystal violet fioletovyy.Kristallichesky R5 0,25% rastvora octene kiseline 100 mlSmeshat. Filtrira. Stain za 5. - 7. min.METODY KONTROLA NUTRIENT SREDBakteriologicheskomu kontrolu predmet pervichnogoposevamateriala srednje i medij za određivanje toksigenih, saccharolytic i biokemijske osobine. Kada proizvodnja sredvazhnym moment je preliminarna kontrola srednje nasoderzhanie amine baze azota.METOD kvantitativno određivanje amino AZOTAPrintsip Metoda je zasnovana na blokira formaldehida u pH7,0 slobodne amine i lužine titracije ekvivalentnogokolichestva karboksilne grupe. Početku i na kraju titrovaniyaopredelyayut potentsiometricheski.Reaktivy: 1. Natrijev hidroksid (NaOH) 0,1N rastvor.2. Solne kiseline (HCl) 0,1N rastvor.4. Formalin (40% formaldehid rješenje). Prije nego što kazhdymopredeleniem potrebno dovesti pH u formalinu 7,0.Hod opredeleniyaDlya analizom dati količinu tekućine uzorka. Dlyazhidkih hidrolizata sa niskim stepenom digestije (0,1 - 0,2% amin azota) - 3 ML- sa prosječnom ocjenom cijepanja (0,3 -0,6% amin oksid) - 1 ML- s visokim stupnjem cijepanja (0,7 -1,3% amin oksid) - 0,5 ML- tečnost podloge (0.08% -0.04 amin azota) - 3 ML- tečni ekstrakti (0.02 -0.04% amin oksid) - 10 ml.V čašu od 50 ml test uzorka i da dovodyatobschy volumena destilirane vode do 20 ml. Elektrodypotentsiometra uronjen u testu rješenje i pHrastvora prilagođen 7,0 sa 0,1N NaOH 0,1N rastvoraHCl ili rješenje. Zatim 2 ml neutralne formalinu i izazvao bez skidanja elektrode, sadržaj uzorka se titrira koristi 0,1Nrastvora NaOH pH 9,1. U titracije treba ispolzovatmikrobyuretku 5 ml.Soderzhanie amino azota u uzorku u% (X) se izračunava po formuli: A x K x 1,4 x 100X = ----------------- , gdeB x 1000A - broj 0,1N NaOH u ml koji je otišao u titrovanieissleduemoy uzorak K - korekcije na titar 0,1N NaOH-1,4 rješenje - iznos od amina dušika u mg što je ekvivalent za 1 ml NaOH-100 0,1Nrastvora - faktor konverzije u interesu-B - količina tekućine uzorka u mililitrima uzima za analizu-1000 - koeficijent konverzije mg g.METOD BAKTERIOLOŠKE KONTROLA NUTRIENT SREDV praktične laboratorije zhdaya serije kulture medija, posebno kada se koristi nove baze (ililaboratornogo industrijske proizvodnje) i novih sastojaka podlezhitbakteriologicheskomu kontrola zbog njihove moguće nestandartnosti.1. Kontrola kvalitete medija za setvu primarne issleduemogomateriala postavio određivanje: a) klijavost ćelije Corynebacterium difterija-b) vremena za formiranje kolonija) ingibiruyuscheyaktivnostiv poštuju soputstvuyuscheymikroflory.S koristi za ovu svrhu kontrole toksigenih soj ilisvezhevydelennye toksigenih kulture Corynebacterium difterije stipichnymi kulturno - morfološka svojstva shtammzolotistogo aureus (музейный или свежевыделенный).Суточные культуры коринебактерий дифтерии и стафилококка,вы ращенные на сывороточном агаре, смывают физиологическимраствором. Мутность полученной суспензии должна соответствовать10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. LA Тарасевича(условно 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл взвеси). Из исходныхвзвесей культур коринебактерий дифтерии и стафилококка готовятпоследовательные разведения вфизиологическомрастворе(см. схему).СХЕМАПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КУЛЬТУРЫ КОРИНЕБАКТЕРИЙДИФТЕРИИ И СТАФИЛОКОККА+-----+-----------+---------------------------+------------------+| N | Кол-во | Объем вносимой | Условное кол-во ||про- | физиол. | суспензии, мл | микр. клеток ||бирки| р-ра, мл | | в 1 мл взвеси |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 8 || 1 |1,0| 1,0 из исходной взвеси| 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 7 || 2 |4,5| 0,5 из 1-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 6 || 3 |4,5| 0,5 из 2-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 5 || 4 |4,5| 0,5 из 3-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 4 || 5 |4,5| 0,5 из 4-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 3 || 6 |4,5| 0,5 
Udio u društvenim mrežama: 

 
Povezani
 
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.
Medicinski zakon: zakon, dokumenti, odgovornosti, pravila, akata.